鼠尾提取DNA方法

转基因小鼠筛选——鼠尾提取基因组DNA方法

1.小鼠分笼后打耳标，剪取小鼠尾尖3mm--5mm左右于1.5mL离心管中，标记耳标号。

2.配置消化液，每管加入消化液0.5mL，55℃，3-5h,或放置过夜。（最长可放置3天）。

3.加1倍体积（0.5mL）PCI(下层液体)，上下颠倒10余次。（PCI可分装出一些现用，以免操作不慎污染）。

4.室温15000rpm离心，10min。

5.小心取上清约0.4mL入新管，依次标号，加入异丙醇0.4mL，上下倒转10次左右。

6.4℃，15000rpm离心，5min。

7.弃上清，滤纸吸干，加入70%乙醇0.5mL，将管底沉淀弹起，上下颠倒几次，洗涤。

8.4℃，15000rpm离心，5--7min。

9.弃上清，瞬时离心，用吸干剩余液体，后经空气干燥5-10min。 10.加入1*TE 60-170μL一般加100μL，振荡30min溶解，于4℃冰箱保存。 注意事项：

1.小鼠耳标与管号一一对应，在剪尾或提取DNA过程中如发生混淆，则应重新剪尾。

2.配置消化液时，最后加蛋白酶K，配置完成后混合均匀再分装；分装后依次检查，确认每管的鼠尾都浸入在消化液中。尽量多配一些消化液，以免不够。

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3.提取DNA之前，先检查鼠尾消化情况，过夜消化后，一般只能观察到少量骨骼及鼠尾毛发，如观察到鼠尾组织，说明消化不完全，可能是时间不够或消化液配置不正确。

4.由于实验中用到的PCI，异丙醇等对身体有害，因此在提取DNA和配置PCI时，应注意防护，戴好口罩和乳胶手套。

5.实验过程中，应轻拿轻放，避免液体洒出，沾湿手套，洗去Marker笔字迹等情况的发生。为了防止耳标号被擦掉，最好连号摆放。

6.吸取上清一步中，应保证上清质量，避免下层杂质的吸入，如不慎吸入，应将样品重新离心。

7.DNA沉淀一般呈白色或半透明胶状，混有杂质时可能带有黑色，提取过程中如观察不到沉淀，应做好标记，重新剪尾。

8.DNA样品保存于4℃冰箱，保存时应标明剪尾日期，小鼠品系等各项资料，以便查找。

9.使用离心机时，离心管尽量分散放。

10.吸取挥发有腐蚀性液体时，应用带过滤装置的头，以免腐蚀。（如酚﹑强酸﹑强碱等。)

11．各管之间应隔开放，以免加液时混淆。

12.固定一把专用于吸取腐蚀性液体，如酚等。消化液配方1管 20*SSC 0.5M EDTA 10% SDS MQ H 2025μL 1μL

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50μL 415μL4管 0.1 mL 4μL 40μL 0.2 mL 20μL10管 10μL 0.1 mL 0.5 mL 50μL20管 20μL 0.2 mL 1.0 mL 100μL40管1 mL 40μL 0.4 mL 2.0 mL 200μL60管1.5 mL

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60μL 0.6 mL 3.0 mL

300μL80管2 mL80μL 0.8 mL 4.0 mL400μL 0.25 mL0.5 mL 1M Tris-Hcl10μL

1.66 mL4.15 mL8.3 mL16.6 mL25.8 mL33.2 mLProteinaseK5μL PCI配方：Tris-

TE配方：Tris-Hcl 0.25饱和酚：三氯甲烷：异戊醇=25：24：mL0.5M EDTA 0.05mL加MQ H 20至25mL

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