齐鲁细胞TIL细胞治疗手册

肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes，TIL）是通过采集患者胸腔积水或者腹水，经过体外激活扩增培养，得到的一种在生理条件下能够杀伤肿瘤细胞的细胞群。它是新一代的特异性免疫活性细胞疗法，具有高效、特异、副作用小等优点，可有效辅助恶性肿瘤的治疗。

恶性顽固性胸腹水多数为晚期肿瘤或转移瘤所引起的严重并发症，也称癌性腹水，用常规的手段治疗效果不佳，不良反应大，且易反复。癌性胸腹水在最初可能对生活质量影响不大，但如果进展迅速可导致病情恶化及死亡，应及时采取相应措施控制癌性胸腹水，缓解症状，为全身治疗创造条件，提高患者的生活质量，癌性胸腹水的淋巴细胞是一种特殊形式的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL细胞），主要源于T淋巴细胞，它对肿瘤细胞具有一定的识别能力，但杀伤活性低。从癌性胸腹水中分离并提取TIL细胞，经一系列细胞因子体外诱导并扩增后将其回输到患者的胸腹腔中，可通过以下几种途径发挥治疗作用：a. TIL细胞能特异性识别并杀伤自体肿瘤细胞，引起肿瘤供血血管的损伤，使其闭塞，减少渗出并发挥抗肿瘤作用，有效抑制肿瘤细胞的正常生长；b. TIL细胞可抑制肿瘤细胞产生的能损伤腹膜表面的蛋白因子，抑制细胞内组织胺成分的释放，一减轻腹膜表面的渗出，并促进损伤的腹膜表面的修复，使渗出液尽快吸收，从而达到治疗作用；c. 提高机体免疫功能。

该治疗项目能有效控制胸腹水积液、缓解症状、提高患者的生活质量，且副作用小，症状改善的同时也为临床其他治疗如手术、化疗、放疗创造了条件，提高肿瘤综合治疗的疗效。

2、TIL的抗肿瘤途径

TIL细胞杀伤肿瘤细胞主要依赖其中的CTL细胞的有效激活和有效行使功能。T细胞转化为效应细胞，需要有两个刺激信号，第一激活信号由TCR与抗原肽：MHC分子复合物结合提供；第二激活信号T细胞上的CD28与抗原提呈细胞(APC)上B7分子结合提供。通过该途径杀伤肿瘤细胞机制目前已经清楚，另外研究证明TIL杀伤肿瘤还有3条途径：①Fas介导的细胞凋亡，其主要机制为淋巴细胞通过表面的Fas配体（FasL）与靶细胞上的Fas结合，引起细胞DNA片段化，导致细胞发生凋亡。②穿孔素/颗粒酶B介导的细胞凋亡。③TIL分泌一些分子如TNF-α，IFN-γ等介导的细胞溶解与凋亡，该

途径可通过释放颗粒或直接细胞接触杀伤靶细胞。 3、TIL细胞表型

TIL主要是由T细胞、NK细胞组成。在抗瘤作用中， T细胞是最主要的免疫效应细胞，并且T细胞中以CD4+、CD8+为主。Radoja等发现TIL细胞群还可表达多种激活标记物，有CD69、CD95L、CD122和LFA-1以及分泌IL-2。

关于扩增后的TIL表型变化，大多数的实验结果均显示CD4+细胞比例呈增长趋势，而CD8+细胞比例增长趋势明显，CD4+/CD8+比例降低。在不同的培养时期，TIL表型也有差异。初始分离时TIL表型以CD3+T细胞为主，CD4+/CD8+值为1.24，说明机体免疫功能处于抑制状态，经培养后CD8+T细胞的比率明显升高，CD4+/CD8+值下降为0.28~0.29。这表明几乎激活所有的细胞毒性T淋巴细胞，使得CD3+CD8+T细胞成优势生长。

4、TIL的实验和临床应用

1988年Rosenberg等首次应用TIL静脉回输并联合IL-2、CTX治疗20例恶性黑色素瘤，其中12例达到部分或完全消退。此后研究人员陆续做了许多实验，2002年Rosenberg实验室在Science上发表了研究成果。他们采用TIL对13例化疗无效的晚期恶性黑色素瘤患者进行免疫替代疗法，结果6例获得部分缓解，4例取得混合型疗效。

目前国内外报道TIL对肿瘤引起的恶性胸腹水具有良好的治疗作用。国内有学者对50例体腔积液患者进行TIL治疗。50例患者中18例由肺癌引起的胸腹水，8例是乳腺癌引起的胸水，6例由肝癌引起的胸腹水，10例结直肠癌引起的胸腹水，5例卵巢癌引起的胸腹水，3例是其它原因引起的胸腹水。经过TIL治疗后，结果见下图。

Fabbri等采用TIL联合IL-2对39例病人进行治疗，结果.7%病人生存期超过37个月；44.4%病人生存期超过21个月；2例病人完全治愈。 5、TIL细胞的适用症和禁忌症 5.1. TIL细胞的适用症

适用于各种恶性胸腹水 5.2. TIL细胞的禁忌症

a) 脏器移植者；

b) T细胞淋巴瘤、T细胞白血病； c) 严重的自身免疫性疾病者； d) 不可控制的感染性疾病；

e) 对细胞培养过程中所用生物制剂过敏者； f) 怀孕或哺乳期妇女；

g) 器官功能衰竭者,具体器官标准如下：

i. ii. iii. iv. v.

心脏：IV级以上

肝脏：达到国内肝功能分级C级以上 肾脏：肾功能衰竭及尿毒症

肺：出现严重的呼吸衰竭症状，累及到其他脏器，如肝、肾功能 脑：脑转移并伴意识障碍者

6、TIL细胞治疗恶性胸腹水方案

采集恶性胸腹水后，14天左右回输TIL细胞，直接注射到胸腹腔，回输前将胸腹水抽干。

7、采集胸腹水及注意事项 7.1. 采集前工作

7.1.1. 患者填写知情同意书

由医生根据患者病情提出TIL细胞治疗并填写患者信息表，患者签署知情同意书。 7.1.2. 患者提供化验结果

a） 血常规（患者未经其他治疗时，7天内有效），此结果必须提供； b） 感染筛查（患者未经其他治疗时，30天内有效），此结果必须提供；

c） 肿瘤标志物（患者未经其他治疗时，30天内有效），此结果建议提供；以进行治疗评价；

d） CT或X光片、B超（患者未经其他治疗时，30天内有效），此结果建议提供，以进行治疗评价；

e） 病毒拷贝数检测（患者未经其他治疗时，7天内有效），对慢性病毒感染患者，此结果建议提供，以进行治疗评价；

f） 血生化全项（患者未经其他治疗时，7天内有效），此结果建议提供；以进行治疗评价。

7.1.3. 医生提供其它治疗安排

a） 目前无其它治疗； b） 手术时间安排； c） 化疗时间安排；

d） 放疗时间安排； e） 靶向治疗时间安排； f） 抗病毒治疗时间安排。 7.1.4. 采集时间的确认

医生结合实验室检查结果和临床安排确认采集时间并通知业务人员（最好根据手术、放化疗的疗程同时制定好回输计划）。 7.1.5.患者缴费

主管医生收到患者缴费相应单据后安排人员进行采集操作。 7.1.6. 采集

无菌条件下采集胸腹水800-1000ml，10 IU/ml 肝素抗凝，储存于采血袋中。 7.2. 采血用具的准备

一次性使用真空采血针组件（Blood Collection Set）、肝素、采血袋、棉签、碘伏、胶带和止血带。 8、细胞回输及注意事项 8.1.回输日期的通知和确认

8.1.1. 业务员在采血后一周内以E-MAIL形式通知主管医生下周回输安排，并以电话、短信形式提醒医生查看E-MAIL。

8.1.2. 确定本次回输不受其他治疗因素，尤其是患者感染、发烧、放疗、化疗、转院、出院等的影响。如果因为患者自身或其他原因，需要改变回输时间，一般只能上下浮动1-2天。

8.1.3. 细胞制备中心如发现因细胞增长原因，培养时间需要延长，将及时告知主管医生。 8.2. TIL细胞的包装盒质量检验单

8.2.1. 标准回输袋100mL TIL细胞悬液，细胞回输袋外标注有患者姓名、细胞编号、患者所在医院、产品出库时间：即当天日期的标签。 8.2.2. 接收产品者还应同时获得产品验收单，包括：

a） 细胞质量报告单（包括微生物检测、内毒素检测和产品细胞数量，并有报告人和审核人姓名，同时加盖质检章）；

b） 细胞回输签收单。 8.3. TIL细胞的运输

8.3.1. 细胞储存于细胞运输箱，箱内放冰袋，保持箱内温度在10-20度，通过专人运输或

快递的方式送至医生指定地点。 8.3.2. 由主管医生或护士

a） 签收产品和产品质量报告； b） 在TIL细胞回输签收单上签名。 8.4. TIL细胞回输 8.4.1. 所需物品：

a） 生理盐水、治疗盘及相关物品（由医院提供）； b） 输血器、7号或更大号套针管（由公司提供）。 8.4.2. 操作人员：医院相关医务人员

8.4.3. 回输前首先核对TIL细胞袋标签姓名与患者姓名是否一致 8.4.4. 回输方法：

a） 连接100mL生理盐水与输血器，将输血器原装所带大号针头换成套管针并排气； b） 将针头与病人血管连接固定，观察生理盐水点滴情况；

c） 预处理：一般不需任何预处理，但若患者为过敏体质或其它情况需根据医嘱加入相应处理，比如回输前提前15分钟肌肉注射非那根25mg；

d） 如果生理盐水点滴通顺，换上细胞转输袋，调节速度为30-40滴/分；

e） 一般病人观察10分钟后如没有特殊反应，将滴速改为60-80滴/分，直至输完；若患者有心血管方面疾病应按医嘱控制滴速。回输过程中可叮嘱家属或护士每隔5-10分钟轻轻挤压转输袋底部，使沉淀细胞重新悬浮；

f） 细胞回输完毕后将输血器连接上剩余的生理盐水，冲洗输血器内剩余的细胞； g） 管内细胞冲洗干净后回输完成。 9、其他注意事项 9.1.知情同意书

书面证明患者本人或家属已了解TIL细胞治疗的情况并同意接受治疗，由医院保留。 9.2.回输方案的制定

单独使用TIL细胞时，一般在采集后第14天开始第一次回输，具体回输计划在采血后7天内告知主管医生；

如TIL细胞配合手术、放化疗使用，需要医生提供手术、放化疗的疗程及时间安排，并与公司技术人员一起制定回输计划，并确定采集时间。 9.3. 胸腹水、细胞的储存及运输要求

胸腹水样本采集完成后要求在10-20℃之间储存，在8小时内运输到达实验室； 细胞在收获后回输前要求在10-20℃之间储存和运输，在12小时内完成回输。 封底

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