高活力糖化酶菌种选育及发酵研究

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高活力糖化酶菌种选育及发酵研究

谷海先　　张定玲　　曹　钰

(无锡轻工大学研究所,无锡,214036)

摘　要　对黑曲霉(Aspergillaniger)AN2149菌进行自然分离、紫外线和NTG的复合诱变处理,得到了一株高产糖化酶的菌株WG293,经30m3罐发酵试验,发酵总浓度30%,发酵周期为135h条件下,酶活力达29ku󰃗ml,应用于生产证明WG293菌是一株优良的糖化酶生产菌。

关键词　糖化酶　黑曲霉Asp.nigerWG293　选育　发酵

　　葡萄糖淀粉酶简称糖化酶,它从淀粉非还原性末端依次切下一个葡萄糖单位,对淀粉的水解产物为葡萄糖,广泛应用于酒精、白酒、黄酒、抗生素、味精、氨基酸、有机酸、甘油、葡萄糖、高果糖浆等工业中,是工业生产中重要酶类之一,也是我国产量最大的酶制剂产品。几十年来我国的科技工作者为提高糖化酶的活力进行了不懈的努力,使发酵水平不断提高[1,2]。至1990年初糖化酶生产发酵水平达到了12ku󰃗ml左右。我们于1991年自选了高活力糖化酶菌种选育及生产技术研究的课题,通过对本所黑曲霉变异株AN2149进行分离纯化,紫外线、亚硝基胍(NTG)反复诱变和改进发酵工艺条件,使菌种活力得到大幅度提高,摇瓶产酶水平达到23

3

ku󰃗ml,30m罐上发酵水平达到29ku󰃗ml以

1.3.1　筛选平皿培养基蛋白胨1%,淀粉1%,NaNO30.3%,

KCl0.05%,FeSO40.001%,K2HPO40.1%,MgSO30.05%,蔗糖2%,琼脂1.8%。1.3.2　麸皮试管培养基

麸皮∶水=1∶1.2,装于试管中经121℃灭菌1h。1.3.3　摇瓶筛选培养基

玉米粉14%,豆饼粉4%,麸皮1%。1.4　平皿筛选方法

将出发菌株制成孢子悬浮液,用稀释法分离纯化,诱变时孢子悬液经紫外线(30W,距离30cm,照射时间1～10min)、亚硝基胍(NTG,1mg󰃗ml,处理30min)复合处理,于筛选平皿上,经培养挑选水解圈产生早,且水解圈大的菌落,接种于麸皮试管中培养成熟后成试管麸皮孢子,再进行摇瓶复筛。1.5　摇瓶试验方法

500ml三角瓶装50ml筛选培养基,121℃灭菌30min,接入试管麸皮孢子,旋转

上。

1　材料与方法

1.1　原料

市售玉米淀粉、豆饼粉、麸皮、玉米浆、口服葡萄糖等。1.2　菌种

黑曲霉(Aspergilluniger)变异株WG293。1.3　培养基

Ξ收稿时间:1998-03-18

摇床摇瓶转速为270r󰃗min,振幅25cm,32℃培养120h,测定pH和酶活力。1.6　罐发酵1.6.1　一级种子罐

1m3,装量600L,六弯叶涡轮搅拌器,转

速280r󰃗min,接一只三角瓶麸皮孢子,32℃培养45h左右移入二级罐。

32食品与发酵工业　　FoodandFermentationIndustries　　Vol.24　No.5

1.6.2　二级罐

6m3,装量3.5m3,六弯叶涡轮搅拌器,

1.7.3　酸性蛋白酶活力测定

转速220r󰃗min,电机功率11kW,34℃培养

30h左右,移入30m3罐发酵。1.6.3　发酵罐

30m3,装量30m3,六弯叶涡轮搅拌器,

按原轻工部部颁标准测定[3]。1.7.4　淀粉酶活力测定

测定活力的缓冲溶液pH为4.6,测定方法,按原轻工部部颁标准测定[3]。1.7.5　酸度

电机功率55kW,搅拌转速160r󰃗min,34℃发酵,135h左右放罐。1.7　测定方法

1.7.1　糖化酶活力测定

按QB746280标准,原轻工部部颁标准测定[3]。

1.7.2　pH测定

采用上海精密试纸和pH计测定。

以10ml发酵液消耗0.1mol󰃗LNaOH毫升数表示。1.7.6　总糖、还原糖

采用裴林试剂法测定[4]。2　结果与讨论2.1　WG-93菌株的获得表1　各菌株菌落形态的比较AN2149WG2149A

WG293

菌落直径约1.2cm,鹅黄色,中间凹呈盆地形,背面色淡,菌落与培养基结合紧密。

菌落直径约1.2cm,淡黄色,中间凹呈盆地形,有皱褶背面几乎无色,与培养基结合紧密。

菌落直径1.0cm,土黄色,中间隆起,呈乳头状,有皱褶,背面黄色孢子褐色。

表2　不同碳源对三菌株摇瓶发酵产酶的影响

编号

培养基组成玉米粉14%

A

项　目

AN2149

u󰃗mlpH

85604.0

AN2149A116504.0

WG293132004.1

菌　　　　　株

豆饼粉4%麸　皮1%淀　粉10%

发酵情况

u󰃗mlpH

有霉味

21503.0

有霉味

062.8

有霉味

109004.0

B

豆饼粉4%麸　皮1%葡萄糖10%

发酵情况

u󰃗mlpH

结球,有酒味

11503.0

结球,有酒味

3029.63.2

不结球

96044.2

C

豆饼粉4%玉米浆2%

发酵情况结球严重,酒味重结球,有酒味不结球,有霉味

　　以本所酶工程实验室提供的AN2149为

出发菌株,经筛选平皿分离纯化和摇瓶筛选

得到AN2149A菌,发酵水平达到11～12

分离纯ku󰃗ml,再经紫外线、NTG复合处理、

第24卷　第5期　　谷海先等:高活力糖化酶菌种选育及发酵研究33

化和摇瓶筛选得到WG293菌,菌种选育谱系如下:

Asp.nigerAN2149(8.5ku󰃗ml)

分离纯化

Asp.nigerAN2149A(11～12ku󰃗ml)

紫外线

Asp.nigerUV218(12.5ku󰃗ml)

NTG

Asp.nigerWG293(13.0ku󰃗ml)

　　从上表可看出温度对发酵的结果有较大

的影响,温度的控制是发酵过程中一个重要的参数,WG293菌最佳发酵温度为34℃。2.5　淀粉浓度对发酵产酶的影响

采用挡板三角瓶,用不同淀粉浓度的培养基50ml装500ml三角瓶34℃摇瓶发酵,发酵时间137h,转速270r󰃗min,结果如表5。

表5　不同浓度培养基对WG-93菌产酶的影响培养基浓度(%)

pHu󰃗ml224.3

244.2284.0303.9

各菌株在平皿上的形态如表1。

2.2　不同碳源的培养基对各菌株产酶的影响

用AN2149、AN2149A、WG293三株菌株分别用玉米粉、淀粉、葡萄糖为碳源进行摇瓶发酵试验,结果如表2所示。从表2看出AN2149和AN2149A菌在培养基B、C中会结球,产酶活力低,WG293菌在三种培养基中发酵都很正常,有利于采用纯淀粉培养基。

2.3　不同通风量对各菌株产酶的影响

采用摇瓶筛选培养基,500ml三角瓶中分别装入不同量的培养液,按前述方法旋转摇床发酵,结果如表3。

表3　不同装液量对产酶的影响

装液量(ml)

AN2149AWG293

251219013501

501096012600

75832010900

10051008200

16950195152188023100

　　从表5看出采用高浓度培养基在供氧充足时发酵单位随浓度的增加而增加,培养基达30%浓度时摇瓶单位达23ku󰃗ml。2.6　WG-93菌发酵中的其它酶的产生情况

糖化酶发酵中如果Α2淀粉酶含量过高会引起糖化酶测定结果偏高,酸性蛋白酶含量过高则不利于酶的保存和应用。因此有必要考察WG293发酵中其它酶的含量,按前述摇瓶试验方法培养基采用淀粉10%、豆饼粉4%、麸皮1%,发酵液分析结果如表6所示。

表6　WG-93菌发酵中其它酶产生情况批次

123

pH4.24.04.1

糖化酶

(u󰃗ml)116001221011985

2淀粉酶酸性蛋白酶Α

(u󰃗(u󰃗ml)ml)

343038

1701165

　　从表6看Α2淀粉酶、酸性蛋白酶的含量不高。

2.7　30m3罐试验情况

表7　30m3罐试验结果

批次

123

　　从表3可看出装液量大小对产酶有较大影响,因此发酵中需要供给足够的风量。与出发菌株相比装液量对WG293菌的影响要小些。

2.4　培养温度对WG-93菌产酶的影响

本实验采用摇瓶筛选培养基于500ml三角瓶中装50ml培养液在不同温度下经旋转摇床发酵120h,结果如表4。

表4　不同发酵温度对WG-93菌产酶的影响温度

u󰃗ml

30℃8600

32℃10720

34℃12030

36℃9080

发酵时间

(h)150134135

pH4.4.44.6

酶活力

(u󰃗ml)22842029797255

残糖

(%)0.710.420.4

平均

(下转第36页)

36食品与发酵工业　　FoodandFermentationIndustries　　Vol.24　No.5表2　方法回收率试验结果

2.9　国标法与本法对比试验

回收率

(%)97.095.0105.0

样品大白菜莴笋大米

本底值标准加入量回收量

(Λg)1.972.580.012

(Λg)3.003.001.00

(Λg)2.912.851.05

取大白菜、莴笋及大米加标样品,将国标法[4]与本法测定结果进行比较,结果基本一

致(见表3)。

本文提供了一种简便易行,准确度高的测定蔬菜和大米中痕量钴的方法。

参　考　文　献

表3　方法对比试验

样品大白菜莴笋大米加标

国标法(Λg󰃗g)

1.932.600.88

本法(Λg󰃗g)

2.012.561.03

1　霍克若.分析化学,1984,12(6):5582　JohnsonDA,FlorenceTM.Talanta,1975,22(3):2533　徐亚萍.中国卫生检验杂志,1994,4(2):884　中华人民共和国国家标准.GB󰃗T8538-1995,63(上接第33页)

表8　典型发酵批次

发酵时间

(h)0297397121129135

pH4.584.3.4.474.8.624..6

述罐发酵方法发酵,0～14h通风比为1∶

0.5,14h至放罐通风比为1∶0.8,发酵温度

酶活力

(u󰃗ml)

酸度

3.04.04.55.04.07.06.04.5

残糖

(%)19.117.915.611.38.24.12.10.4

34℃,发酵结果如表7,典型批次发酵曲线如

表8。

参　考　文　献

225971351261518502265712773129797

10

1　张树政.酶制剂工业.北京:科学出版社,1984.4～499

2　邬显章.无锡轻工业学院学报,1987(4):1～3　中华人民共和国轻工部部颁标准,QB747-80,1981

4　工业发酵分析.北京:中国轻工业出版社5　邬显章等.酶的工业生产技术.吉林:吉林科

　　培养基采用玉米淀粉为碳源、豆饼粉为

氮源作培养基,培养基总浓度为30%,按前

学技术出版社,1988.391～405

6　章名春.工业微生物诱变育种.北京:科学出

版社,1984