PCR室丙型肝炎病毒核酸定量检测 【产品名称】 通用名称：丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR一荧光探针法) 英文名称：Diagnostic Kit for Quantification of Hepatitis CVirus RNA(PCR-Fluorescence Probing) 【包装规格】32人份／盒 【预期用途】 本试剂盒采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于对临床血清或血浆标本中的丙型肝炎病毒核酸RNA的定量检测，本品可用于对丙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。 【检验原理】 本品系由丙型肝炎病毒特异性引物、荧光探针、以及Taq酶等成分组成，采用PCR体外扩增的方法，通过荧光信号的变化，定量检测人血清或血浆标本中的H CV RNA。 【主要组成成份】 1．病毒RNA提取试剂 裂解液 4ml／瓶×1 含有硫氰酸胍的溶液 去抑制剂 1瓶 含有去抑制剂的冻干粉末 助沉剂 1瓶 含有助沉剂的冻干粉末 洗涤液A 14ml／瓶×1 含有硫氰酸胍的溶液 洗涤液B 4ml／瓶×1 含有Tns的溶液 洗脱液 1．8ml／支×2 含O．04％NaN3的纯化水(无RNase) 核酸提取柱32支，包×1 2．核酸扩增(PCR)一荧光检测试剂 RT—PCR试剂 PCR主反应液 250u1／支×1 含有一对引物和 dNTP的溶液 酶混合物 180u1支×1 含有Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂的溶液 荧光探针对照品 20u l／支×1 含有荧光探针的溶液 阴性对照 250ul×1支 含有0.05％NaN 3的HCVRNA阴性的混和人血清或血浆 强阳性对照 250ul×1支 含有约2× 1061LJ／ml的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 弱阳性对照 250 ul×1支 含有约2×104IU ／ml的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品① 250 ul×1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品② 250 ul×1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品③ 250 ul×1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品④ 250 ul×1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品①～④的参数和强、弱阳性对照的定值允许范围根据批号 不同而不同。详见试剂盒的说明书附页。 3．说明书 1份 4．自备试剂和实验器材 以下自备试剂和实验器材为产品中不包含，但为实验所必须。 自备试剂：无水乙醇(分子生物学级)：30ml。 自备实验器材：0.5ml、2ml离心管，确保无RNA酶。200uL带滤芯吸嘴，确保无RNA酶。1000u1带滤芯吸嘴，确保无RNA酶。各种规格的加样器，高速离心机，震荡仪，恒温加热仪(水浴或干热)，负压装置，荧光PCR仪。 【储存条件及有效期】 储存时，须置-20℃保存。有效期12个月。 【适用仪器】 本试剂盒适用单色或多色波长实时荧光PCR仪器，如：Roche LightCycler、ABl5700、ABl7300、ABl7500、博日Line-Gene等。 【样本要求】 样品可采用血清或血浆样本。血清以立即采集分离为好，采血6小时内必须分离、收集血清，并将血清转移至一次性使用的无RNA酶的无菌微量离心管中。血浆不能用肝素做抗凝剂。样品如不及时检测，应于-20℃至-80℃冻存。标本运输应于冷冻条件下进行。 【检验方法】 1.标本处理(所有操作需采用无RNA酶的带滤芯吸嘴及离心管，在标本处理区进行) 1.1实验前准备 1.1.1将裂解液置70℃加热5分钟，使试剂瓶内的结晶全部溶解。吸取lml裂解液加到助沉剂的试剂瓶中，用吸嘴搅动，混匀后全部吸回到裂解液瓶中，混匀后备用。 1.1.2在去抑制剂的试剂瓶中加入700u1洗脱液，用吸嘴搅动，溶解后混匀备用。 1.1.3在洗涤液A的瓶子中加入6ml无水乙醇，颠倒混匀后备用。 1.1.4在洗涤液B的瓶子中加入 16ml无水乙醇，颠倒混匀后备用。 1.2.病毒RNA提取 1.2.1 取N个O.5ml离心管(N=标本数量+阴性对照、强阳性对照、弱阳性对照和4个工作标准品)，作好标记后分别加入100ul已混有助沉剂的裂解液。 1.2.2分别用带滤芯吸嘴加入100ul需处理的血清或血浆标本和对照品，用带滤芯吸嘴反复吹打5次。 1.2.3再分别用带滤芯吸嘴加入20ul去抑制剂，盖上管盖，振荡混匀，离心数秒，置70℃反应10分钟。 1.2.4离心数秒，用带滤芯吸嘴加入110ul无水乙醇，振荡混匀，离心数秒。 1.2.5将作好标记的核酸提取柱插入连接管后，固定在负压装置上，将步骤1.2.4中的所有液体小心移入核酸提取柱。 注意不要将液体溅入其它样品的核酸提取柱内。 1.2.6开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。 1.2.7在每个核酸提取柱内加入500ul洗涤液A，开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。 1.2.8在每个核酸提取柱内加入500ul洗涤液B，开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。 1.2.9从连接套管上取下核酸提取柱，将其放入无RNA酶的2ml离心管中，盖上管盖， 14000rpm离心1分钟。 1.2.10将提取柱放入一新的2ml离心管中(确保采用无RNA酶的离心管)，小心将50pJ洗脱液加在柱面，静置1分钟。 1.2.11盖上管盖， 10000rpm离心1分钟，取2ml离心管中的收集液12.5ul做PCR反应模板。 2．RT—PCR试剂准备(在PCR前准备区进行)。 从试剂盒中取出PCR主反应液、酶混合物和荧光探针，室温下融化后离心数秒，按照待扩增标本数量x，取PCR主反应液：酶混合物：荧光探针：7：5：0．5混合，充分混匀后离心数秒，分装至PCR毛细反应管中，每管12.5ul，将装有PCR反应液的毛细反应管转移至标本处理区。 RT·PCR扩增反应液配制表 扩增样品数 PCR主反应液 酶混合物 10 20 77ul 1ul 55ul 110ul 荧光探针 合计 5.5ul 11ul 137.5ul 275ul 30 32 231ul 245ul 165ul 175ul 16.5ul 17.5ul 412.5ul 437.5ul 3.加样(在标本处理区进行) 3.1在装有PCR反应液的毛细反应管中用带滤芯吸嘴分别加入12.5脚已处理好的标本(标本处理步骤1.2.11离心管中的洗脱液)。 3.2盖上管盖，离心数秒后转移到扩增检测区。 4.PCR扩增检测(在扩增检测区进行) 4.1将毛细管放入LightCycler扩增仪进行扩增检测。 4.2循环参数设定：(请参照各类仪器的操作软件进行设置) 步骤 1 2 温度 Roche LightCycler 50℃ 94℃ 93℃ 3 55℃ 72℃ 4 5 93℃ 60℃ 40℃ 非Roche仪器 50℃ 94℃ 94℃ 55℃ 72℃ 94℃ 60℃ 40℃ Roche LightCycler 25分钟 2分钟 15秒 15秒 15秒 3秒 45秒 30秒 时间 非Roche仪器 25分钟 2分钟 15秒 15秒 15秒 10秒 45秒 30秒 42 1 5 1 1 循环数 步骤4中60℃是荧光检测 4.3荧光检测通道：F1 5.结果获取 1.选F1或F1／F2通道，点击Quantification按纽，进入数据分析界面。 2.在数据分析窗口中，将噪音线Noise Band的位置移至刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点，且C丁值不出现任何数值为准(可根据仪器本身的实际情况加以调整)，得到各标本的HCVRNA检测结果。 【参考值(参考范围)】 1．本试剂盒的定量线性范围：10≤测定结果≤10lU／ml。 2．定量对照的标准曲线的相关系数| r |≥0．950。 3．阴性对照的测定结果为０。(结果不显示任何值) 4月虽、弱阳性对照的定量结果在试剂盒提示的规定允许范围内。 【检验结果的解释】 1．本试剂盒的检测灵敏度~500lU／ml，定量线性范围为10≤检测结果≤10lU／ml。 2．定性结果判断： 2．1测定结果为0(无数值)的标本为HCV RNA阴性标本。 2．2测定结果≥500lU／ml的标本为HCV RNA阳性标本。 3．定量结果判断： 3．1对于10≤测定结果≤10lU／ml的样本，提示本次测定结果在试剂盒有效定量检测线性范围内。报告上注明其测定结果。 377337 3．2对于测定结果>10lU／ml的样本，提示病毒含量高于试剂盒定量检测线性范围上限，所测结果仅供参考，报告上注明>10lU／ml。若需精确定量，可根据所测结果，将该标本用阴性血清稀释至10~10lU／ml后复测。 3．3对于测定结果500≤测定结果<10lU／ml的样本，提示病毒含量低于试剂盒定量检测线性范围下限，所测结果仅供参考，报告上注明<10lU／ml，建议随访。 3．4测定结果为O(无数值)的标本为HCV RNA阴性标本。 【产品性能指标】 1．物理性质：外包装印刷准确，完好无损。试剂盒内液体组分齐全，密封良好，无漏液现象。 2．阴性对照：检测结果阴性。 3．工作标准品：测定值符合下列范围，线性相关系数| r |≥0.95，定量单位为lU／ml。 工作标准品①：3.K1×10～2.83K1×10lU／ml 工作标准品②：3.K2×10～2.83K2×10lU／ml 工作标准品③：3.K3×10～2. 83K3×10lU／ml 工作标准品④：3.K4×10～2.83K4×10lU／ml 注：K1、K2、K3、K4为标定的工作标准品参数。详见试剂盒说明书附页。 4．强、弱阳性对照的定量结果在试剂盒提示的规定允许范34455667334677围内。 5．阴性参考品符合率：国家阴性标准品检测结果不得出现假阳性，符合率。10／10。 6．阳性参考品符合率：国家阳性标准品检测结果不得出现假阴性，符合率。10／10。 7．试剂的最低检出量：用最低检出量定量标准品检定，其试剂的最低检出量应不大于10lU／ml。 【注意事项】 1．待检新鲜血标本若不及时检测，应保存于-20℃。 2．试剂盒各组份使用前请充分融化并摇匀，离心管内的试剂需离心数秒后使用。 3．PCR操作各阶段应在不同实验室进行。 4．在试剂和标本准备阶段使用负压超净台。
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