宁夏农林科技，Ｎｉｎｇｘｉａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａ ．ａｎｄ Ｆｏｒｅｓ．Ｓｃｉ．＆Ｔｅｃｈ．２０１５，５６（０７）：４３—４４ ４３ 向日葵珍贵种质资源快速繁殖方法一茎尖培养技术 孙敏 ，赵力之 ，滕刚福３，夏禹宏 ，李慧英１，刘壮 １．吉林省向日葵研究所，吉林白城１３７０００ ２．吉林省松原市绿色食品办公室，吉林松原 １３８０００ ３．吉林省农安县农业局，吉林农安 １ ３０２００ 摘要：利用改良ＭＳ培养基，对向日葵野生种的茎尖组织进行离体培养，快速获得无菌母株。将无菌母株的节间组织和茎 尖组织切割后在添加根皮苷、银和水解酪蛋白的培养基上继代培养，进一步扩繁出大量植株。在继代培养之前通过将 外植体浸入ＩＢＡ溶液诱导生根。采用离体培养技术，在较短时间内获得了大量遗传稳定性一致的个体，为进一步科研工作 提供数量充足的植株材料。 关键词：向日葵；野生种；茎尖组织；离体培养 中图分类号：￥５６５．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２—２０４Ｘ（２０１５）０７－００４３－０２ Ｒａｐｉｄ Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｅｃｉｏｕｓ Ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｂｙ Ｓｈｏｏｔ－ｔｉｐ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＳＵＮ Ｍｉｎ ｅｔ ａ１． （Ｊｉｌｉｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ，Ｂａｉｃｈｅｎｇ，Ｊｉｌｉｎ １３７０００） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｇｅｒｍ—ｆｒｅｅ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｗｉｌｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｓｈｏｏｔ—ｔｉｐ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｗｉｔｈ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅ ｓｔｅｒｉｌｅ ｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｈｏｏｔ—ｔｉｐ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｗｅｒｅ ｃｕｔ ａｎｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎ， ｓｉｌｖｅｒ ｎｉｔｒａｔｅ ａｎｄ ｃａｓｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｐｒｏｐａｇａｔｅ ｌａｒｇｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｐｌｎａｔｓ．Ｐｒｉｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｈｅ ｅｘｐｌｎａｔｓ ｗｅｒｅ ｉｍｍｅｍｅ ｉｎ ＩＢＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒｏｏｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ａ ｌｏｔ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｗｅｒｅ ｇｏｔ ｂｙ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌ ｆｏｒ ｆｕｎｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ ａ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｓｈｏｒｔ ｔｉｍｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｓｕｎｆｌｏｗｅ￣Ｗｉｌｄ ｓｐｅｃｉｅｓ；Ｓｈｏｏｔ—ｔｉＤ ｔｉｓｓｕｅ；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ 向日葵是世界上最重要的油料作物之一，在世界各地 成员一起探索利用茎尖离体培养方法快速扩繁向日葵野生 广泛种植。但是，由于向日葵栽培种相对狭窄的遗传变异基 种，以便为种间原生质体融合提供充足数量用于分离原生 因基础，使得向日葵生产一直面临着诸如菌核病、黄萎病、 质体的无菌供体植株材料。借鉴其他植物茎尖离体培养技 黑斑病、褐斑病、拟茎点病等病害的困扰，这些病害有时严 术嘲，我们通过对培养基的筛选、试材不同取样时间对比以 重发生，对向日葵科研与生产造成较大影响。时至今日，对 及离体培养条件的摸索，最后总结出一套具有可操作性的 于向日葵菌核病的侵染仍然没有十分有效的化学防治措 向日葵野生种茎尖离体培养方法。笔者重点介绍了向日葵 施，也没有高水平抗性品种问世。生产上主要依靠选用耐病 茎尖离体培养技术，供从事向日葵生物技术方面的工作人 品种、调节播种期等避病措施来减少病害发生，因此抗病育 员参考。 种一直是向日葵育种工作者长期致力解决的关键问题。 １向日葵茎尖培养技术 向日葵起源于北美，在其栖息地存在大量同属野生种， １．１植株材料 在长期的进化过程中经过自然选择，使向日葵野生种中蕴 将从国外引进的向日葵野生种在温室进行盆栽。植株 藏着丰富的对各种病害及逆境具有良好抗性的宝贵基因资 高度为６０ ｃｍ左右时（７～８片叶）作为外植体取样材料。 源。例如，根据南斯拉夫向日葵科学家Ｄｒ．Ｓｋｏｆｉｃ博士通过 １．２培养基准备 向日葵８个野生种的１２个群体对菌核病的抗性研究，发现 采用的培养基配方（ＤＶ培养基）由塞尔维亚生物技术 向日葵野生种Ｈ．ｍａｘｉｍｉｌｉａｎｉ（Ｓｃｈｒａｄｅｒ）的一个后代材料对 专家Ｄｒ．Ｄｒａｎｇａｎ Ｖａｓｉｃ提供。ＤＶ培养基是在Ｍｓ培养基配 菌核病具有较高的抗性［１】，后来经过茎秆接种菌丝体试验得 方基础上改良而成，与ＭＳ培养基相比，该培养基中大量元 到验证。但是，由于向日葵野生种与栽培种亲缘关系较远， 素含量减半，微量元素、维生素含量不变，加人柠檬酸铵铁 有些种间杂交种表现为完全败育，通常运用常规杂交手段 ２ ｍｍｏ１］Ｌ，蔗糖１０ ｇ，ＩＪ，琼脂６ ｓ／Ｌ，ｐＨ值调节到５．７。 将抗性基因导人到栽培种中很难获得成功。随着生物技术 培养３周后需要将无根的不定芽转移到分化培养基中 不断发展，我们设想通过原生质体融合技术获取２个种的 （ＤＶ’培养基）。分化培养基与原改良培养基不同之处在于 体细胞杂交种，克服其性细胞的不亲和性，从而获取种间杂 交后代，将抗性基因导入到栽培种中。 作者简介：孙敏（１９６４－），男，吉林扶余人，研究员，主要从事向日葵育 在中塞向日葵联合育种的科技合作过程中，塞尔维亚 种及配套栽培技术研究。 生物技术专家Ｄｒ．Ｄｒａｎｇａｎ Ｖａｓｉｃ来华工作期间，与课题组 收稿日期：２０１５—０６—３０ ４４ 孙敏，等向日葵珍贵种质资源快速繁殖方法一茎尖培养技术 ５６卷０７期 添加了ＡｇＮＯ ２ ｍｇ／Ｌ，根皮苷５０ ｍｇ／Ｌ，水解络氨酸３ ｇ／Ｌ。 １．３茎尖培养 取长度约１ ｃｍ的向日葵茎尖组织，在３％的次氯酸钙 溶液中浸泡２０ ｍｉｎ消毒，然后用蒸馏水冲洗３次，切成０．５ 材取样时间的选择以及离体培养条件的不断探索，总结出 了一套具有可操作性的向Ｅｔ葵野生种茎尖离体培养方法， 并且利用该技术获得了向日葵野生种的再生植株，纳入育 种程序。 ｏｍ的小块接种在ＤＶ培养基上（与ＭＳ培养基相比，大量元 ２ ｍｍｏｌ／Ｌ，蔗糖１０ ｇ／Ｌ，琼脂６ ｇ／Ｌ，ｐＨ＝５．７）。放入光照培养 箱进行培养，培养时间为３周。 培养３周后将无根的不定芽转移到分化培养基中（与 实践证明，将不定芽在ＩＢＡ溶液中浸蘸是非常有效的 处理的外植体都形成了根。据文献报道，Ｂｕｒｒｕｓ等人采用不 定芽浸蘸高浓度生长素溶液诱导生根进行继代培养ｌ ３】，他们 使用的是ＮＡＡ和ＩＡＡ而不用ＩＢＡ。利用这些初始芽很容易 合原生质体分离的无污染植物材料。 该项工作的目的是探索出利用组培技术对向１３葵野生 种进行快速扩繁的方法，获得离体培养的植株，并且从这些 素含量减半，微量元素、维生素含量相同，添加柠檬酸铵铁 诱导根分化方法。经过ＩＢＡ溶液处理后，５ ｄ内的所有被 ＤＶ培养基不同之处在于添加ＡｇＮＯ ２ ｍｇ／Ｌ，根皮苷５０ 使向日葵野生种得到进一步组培扩繁，产生足够数量的适 ｍｇ／Ｌ，水解络氨酸３ ｇ／Ｅ），接着放入光照培养箱中继续培 养。通过离体培养获得约高１０ ｃｍ具有节间组织和顶端茎 尖组织的试管苗。将叶片被切掉的外植体基部在浓度为１ ｍｇ／Ｌ的ＩＢＡ溶液中浸泡５ ｍｉｎ。然后将外植体接种在分化 植株上分离出原生质体用于原生质体融合试验，计划通过 原生质体融合技术，将向１３葵野生种中含有的抗性基因导 入到向日葵栽培种中。关于原生质体融合技术及原生质体 再生技术已经有公开文献发表嗍。可以按照Ｋａｌｌｅｒｈｏｆｆ和 Ａｌｉｂｅｒｔ描述的方法来进行性状转移及田间鉴定。 参考文献： ［１］Ｓｋｏｆｉｃ Ｄｒａｇａｎ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｆｏｒ Ｓｃｒｌｅｒｏｔｉｎｉａ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １３ｔｈ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ［Ｍ］ Ｐｉｓａ：Ｉｔａｌｙ，１９９２ 培养基上。相同的操作程序每２周重复１次。 在整个培养过程中，光照培养箱内保持光照强度为３４ Ｅ／（ｍ ・ｓ），光暗交替进行，光照时间（ｈ）为１６：８（光： 暗），培养温度为２５℃。 ２茎尖培养技术应用中存在的问题及措施 利用根茎繁殖方法扩繁向日葵野生种，遇到的主要问 题是无菌外植体产量很低，无法保证进一步无菌不定芽的 再生。另外，利用这些外植体再生植株表现为皱缩畸形，叶 片苍白发黄。 在离体培养过程中发现，茎尖组织如果一直在ＤＶ培 养基上生长，则幼芽表现出玻璃苗迹象，并且发育缓慢。后 来通过往培养基中添加酪蛋白水解液、银和根皮苷，帮 助我们克服了这个问题，可以防止出现玻璃苗。在ＤＶ培养 基上培养３周后，转移到ＤＶ’培养基中，可以诱导出根并且 继续正常地生长发育。 ［２］唐焕伟，张兴，李文生．运用茎尖培养技术进行花卉品质改良ｕ Ｊ ＿北方园艺，２００４（２）：６２—６３． ｐ】Ｂｕｒｒｕｓ．Ｍ．，Ｃ Ｃｈａｎａｂｅ，Ｇ．Ａｌｉｂｅｒｔ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｔｉｌｅ Ｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ『肌ｎＭ Ｌ．） Ｒｅｐ．，１９９１，１０：１６１～１６６ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ［４】Ｏｌｉｖｉｅｒ Ｌｕｃａｓ，Ｊｅａｎ Ｋａｌｌｅｒｈｏｆｆ，Ｇｉｌｂｅｒｔ Ａｌｉｂｅｒｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｂｌｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｓｕｎｆｌｏｗｅｒｓ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｏ／／，／ｎＤ２ｓ Ｌ．）ｆｒｏｍ Ｗｏｕｎｄｅｄ Ｉｍ— ｍａｔｕｒｅ Ｅｍｂｒｙｏｓ ｂｙ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｏ—ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ 、ｖｉｄｌ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２０００，６ ３小结与讨论 我们曾经试图采用不同的方法，以期获得向日葵野生 种离体快速繁殖技术的操作程序。通过对培养基的筛选、试 （５）：４７９—４８７． 责任编辑：李晓瑞 ．＿●●‘＿…●● ●．．・－●‘。．．・●●‘。● －．．－●．．・－●‘。－＿ｌ●●‘ ．．●●●‘－ ｔ．．・●。 ．－．●●●＿＿．．・●。 ．．．＿●‘．…・●， ．，．●● ｔ．－＿ｌ●。 ．“－●‘＿…●●。．．＿．●●・＿．．・，Ｉｒａ ．＿ｌ‘●。。．．－．●●＿．．，●●’・．．・－●・ ｔ＿１・●’．…●●●＿●’・＿．・－．．・－●‘‘．－＇－●。．…●●。…，’●’・．．・－●‘－ （上接第３０页） ［１３】王风格，赵久然，郭景伦，等 一种改进的玉米ＳＳＲ标记的ＰＡＧＥ ｌｆｏｗｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ，２００２，１０５：１ １２４—１ １３６ 快速银染检测新方法【７】 农业生物技术学报，２００４，１２（５）： ６０６－６０７． ［１７】匡猛，杨伟华，许红霞，等中国棉花主栽品种ＤＮＡ指纹图谱构 中国农业科学，２０１１（１）： 建及ＳＳＲ标记遗传多样性分析 ２０－２７． ［１４】Ｒｏｌｌ Ｊ Ｆ．ＮＴＳＹｓ—ｐｃ：Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０［Ｍ】．ＮｅｗＹｏｒｋ：Ａｐｐｆｉｅｄ Ｂｉｏｓｔａｓｔｉｃｓ． Ｉｎｅ．，１９９８． ｆ１８】段艳风，刘杰，卞春松，等．中国８８个马铃薯审定品种ＳＳＲ指纹 图谱构建与遗传多样性分析卟作物学报，２００９（８）：１４５１—１４５７ 【１５】房冬梅．向日葵ＳＳＲ分子标记遗传连锁图谱的构建【Ｄ］．呼和浩 特：内蒙古农业大学，２０１３． ［１６】Ｔａｎｇ，Ｓ．，Ｙｕ，Ｊ Ｋ．ｅｔ ａ１．Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ Ｍａｐ ｏｆ Ｓｕｎ— 责任编辑：李晓瑞
