EHS-M-W-002.0生活饮用水中大肠菌群检测细则(多管发酵法)W

适用于生活饮用水、水源水、游泳池水中大肠菌群的测定。技术标准

GB/T 5749-2006 《生活饮用水卫生标准》GB/T 5750.12-2006 《生活饮用水标准检验方法DB

31/0-2015《公共游泳场所卫生管理规范》

微生物指标》

2检测原理

2.1 总大肠菌群指一群在37 ℃、24 h培养能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。2.2 耐热大肠菌群指一群在的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

2.3大肠埃希氏菌是指一群能生长发酵乳糖产酸、产气且在含有荧光底物的培养基上44.5 ℃培养24 h产生β-葡萄糖醛酸酶，分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征性荧光的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。33.1 3.2 3.3 3.4 3.53.63.73.83.93.103.113.12

仪器和设备高压蒸汽灭菌器冰箱：2 ℃—8 ℃恒温培养箱：36 ℃±1 ℃天平PH试纸

恒温水槽：44.5 ℃生物安全柜

紫外光灯：6W、波长366nm 平皿：直径为9cm 试管刻度吸管小倒管

44.5 ℃仍能生长且发酵乳糖产酸、产气，需氧和兼性厌氧

3.13 金属接种环

1

4培养基和试剂4.1

乳糖蛋白胨培养基：称取乳糖蛋白胨于蒸馏水中加热溶解，

充分混匀，分装到带

有倒管的试管中(每管10 mL)，115 ℃高压灭菌20min。（注：双料乳糖蛋白胨即蒸馏水不变，乳糖蛋白胨的成分量加双份。）4.2

伊红美兰琼脂平板：称取伊红美兰琼脂，加热溶解，倾注灭菌平皿，每皿约15ml。冷凝后，倒置4℃冰箱保存，待用。4.34.4

革兰氏染色液（染色方法见试剂使用说明书）EC培养基：称取EC培养基干粉，加热溶解，调

PH为6.9±0.2，分装到带有

倒管的试管中(每管10ml)，121 ℃高压灭菌20 min，备用。4.5

10 %（m/m）硫代硫酸钠溶液：121 ℃高压灭菌20 min。

PH至7.4，分装到带有倒管

4.6 乳糖胆盐发酵培养管：称取乳糖胆盐，加热溶解，调

的试管中(每管5 mL),115 ℃高压灭菌15 min。（注：双料乳糖胆盐发酵管即蒸馏水不变，乳糖胆盐加双份。）

4.7 EC-MUG管：称取本培养基干粉，加热溶解，在

366nm紫外光下检查无自发荧光

后分装于试管中，115 ℃高压灭菌20 min，最终PH为6.9±0.2。5

操作步骤5.15.1.1

总大肠菌群

5管法：无菌吸取10 ml水样加入双料乳糖蛋白胨培养液中，取

1 ml水样加入

单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1 ml水样加入9 ml生理盐水中混匀作10倍稀释后取1 ml(即0.1 ml水样)加入单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接接种五管双料培养基，每管接种10 ml水样。5.1.2

15管法：检验水源水时，如污染严重的水样，应加大稀释倍数，可接种1，0.1，

0.01 ml甚至0.1，0.01，0.001 ml，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1 ml以下水样时，必须作10倍稀释后取1 ml接种。

5.1.3 轻摇试管，使液体充分混匀，置36 ℃±1 ℃培养箱中培养24 h。5.1.4观察每管是否产酸、产气，如不产酸也不产气则报告为大肠菌群阴性；变黄且有气体产生则为试验阳性，需做进一步的证实试验。5.1.5

若液体

平板分离：自试验阳性管中取一接种环培养液，接种到伊红美兰琼脂平板上，

置36 ℃±1 ℃培养箱中培养18～24 h，观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。

2

5.1.6 复发酵试验：挑取可疑大肠菌群菌落进行革兰氏染色，同时接种单料乳糖发酵

管，置36 ℃±1 ℃培养箱中培养24 h。5.1.7

结果报告：凡乳糖发酵管产酸、产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，为大

100 ml水样中总大肠菌群的MPN值。15

若

肠菌群阳性。记下实验的阳性管数，查表得出

管法结果见附表1，5管法结果见附表2，稀释样品查表后所得结果应乘以稀释倍数。所有乳糖发酵管阴性，则报告总大肠菌群未检出。5.2 耐热大肠菌群

5.2.1从测总大肠菌群乳糖发酵试验中的阳性管

（产酸产气）中无菌取1~2接种环菌液

转种于EC培养基中，轻摇试管，使液体充分混匀，置恒温水浴箱中（水浴箱的水面应高于试管中培养基的液面）44.5 ℃培养24±2 h。

5.2.2若只检测耐热大肠菌群时，可用直接多管耐热大肠菌群方法，即在第一步乳糖发酵试验时按《水中总大肠菌群检测细则（多管发酵法）胨培养液，置恒温水浴箱中

》5.2.1或5.2..2接种乳糖蛋白

44.5℃±0.5℃培养18~24 h后，以下步骤同5.2.1。

若产酸产气

5.2.3观察每管是否产酸产气，如不产酸产气则报告为耐热大肠菌群阴性；则为试验阳性，需做进一步的证实试验。

5.2.4平板分离：自试验阳性管中取一接种环培养液，接种到伊红美兰琼脂平板上，置44.5 ℃培养18～24 h，观察菌落形态。

5.2.5复发酵试验：自伊红美兰琼脂平板上挑取可疑大肠菌群菌落进行革兰氏染色，时接种单料乳糖发酵管，置

44.5 ℃水浴箱中培养24 h。

同

5.2.6结果报告：凡在44.5 ℃仍能发酵乳糖产酸、产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，为耐热大肠菌群阳性。记下实验的阳性管数，查总大肠菌群（告每100 ml水样中耐热大肠菌群的（MPN）数值。5.3大肠埃希氏菌

5.3.1接种：从测总大肠菌群多管发酵初发酵试验中产酸或产气的试管中无菌取接种环菌液转种于

EC-MUG管中，或者是按总大肠菌群多管发酵初发酵试验方法将

1~2接种环菌液转种于

EC-MUG管中。轻摇

1~2

MPN）检索表报

待测样品接种，从产酸产气管中无菌取

试管，使液体充分混匀，置恒温水浴箱中（水浴箱的水面应高于试管中培养基的液面）44.5 ℃培养24±2 h。

3

5.3.2培养：将已接种的EC-MUG管轻摇试管，使液体充分混匀，接种后恒温水浴箱中（水浴箱的水面应高于试管中培养基的液面）5.3.3结果观察：培养时间达到后，将

5.3.4结果报告：计算能数，结果以

30 min内置24±2 h。

44.5 ℃培养

EC-MUG管在暗处用波长为366nm功率为6W

MPN）表得出大肠埃希氏菌的最可

的紫外灯照射，如有蓝色荧光产生则表示水样中含有大肠埃希氏菌。

EC-MUG阳性管数，查对应的最可能数（

MPN/100 mL报告。

6注意事项6.16.26.3

本实验要在二级生物安全实验室中进行。

实验室成员应知晓潜在危害，熟悉实验室安全操作规程和技术。

实验室人员要防止针/锐器损伤，使用锐器容器勿断裂、弯折或者重新套上或重复使用注射器、针头；禁止用手接触破碎的玻璃器皿，尽量使用塑料器皿。6.4

工作结束后消毒工作台面。

77.1

相关记录

M-W-00201-2009《生活饮用水中大肠菌群原始记录

附表1

接种量/mL 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3

0.1 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1

总大肠菌群（MPN）检索表（15管法）总大肠菌群/（MPN/100mL）

<2 2 4 5 7 9 2 4 6 7 9 11 4 6 7 9 11 13 6 7

4

接种量/mL 10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3

0.1 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1

总大肠菌群/（MPN/100mL）

2 4 6 8 10 12 4 6 8 10 12 14 6 8 10 12 15 17 8 10

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5

2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 附表1

9 11 13 15 8 9 11 13 15 17 9 11 13 15 17 19

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5

2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5

12 15 17 19 11 13 15 17 19 22 13 15 17 19 22 24

总大肠菌群（MPN）检索表（15管法）续总大肠菌群/（MPN/100mL）

5 7 9 12 14 16 7 9 12 14 17 19 9 12 14 17 19 22 12 14 17

5

接种量/mL 10 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3

0.1 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2

接种量/mL 10 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3

0.1 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2

总大肠菌群/（MPN/100mL）

8 11 13 16 20 23 11 14 17 20 23 27 14 17 20 24 27 31 17 21 24

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5

3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 附表1

20 22 25 15 17 20 23 25 28 17 20 23 26 29 32

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5

3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5

28 32 36 21 24 28 32 36 40 25 29 32 37 41 45

总大肠菌群（MPN）检索表（15管法）续总大肠菌群/（MPN/100mL）

13 17 21 25 30 36 17 21 26 31 36 42 22 26 32 38 44 50 27 33 39 45

6

接种量/mL 10 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3

0.1 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3

接种量/mL 10 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3

0.1 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3

总大肠菌群/（MPN/100mL）

23 31 43 58 76 95 33 46 63 84 110 130 49 70 94 120 150 180 79 110 140 180

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5

4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 附表2

52 59 34 40 47 62 69 41 48 56 72 81

5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5

4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5

210 250 130 170 220 280 350 430 240 350 0 920 1600 >1600

总大肠菌群（MPN）检索表（5管法）

最可能数（MPN）

<2.2 2.2 5.1 9.2 16.0 >16

5个10 ml管中阳性管数

0 1 2 3 4 5

起草人：戴少东起草日期：2009.04.01 审核日期：2009.04.01 批准日期：2009.04.01

审核人：许衍穗技术负责人：计忠发

修订

次数第1次

修订人孙琳

修订日期

2015.08

审核人许衍穗

审核日期

2015.08

批准人批准日期

2015.08

7