多倍体植物中单核苷酸多态性_SNPs_的开发_贺道华

37(5):485~492,2011

JournalofZhejiangUniversity(Agric1&LifeSci1)文章编号:1008-9209(2011)05-0485-08

DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2011.05.003

多倍体植物中单核苷酸多态性(SNPs)的开发

贺道华,邢宏宜,赵俊兴,赵艳宁,齐程,王艳婷

(西北农林科技大学农学院,陕西杨凌712100)

摘 要:单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由单核苷酸的变异所引起的一种DNA序列多态性.在人、拟南芥、水稻等二倍体生物中,已经开发出大量的SNP标记并被用于群体结构分析、关联作图等研究,而在棉花、油菜、小麦等多倍体植物中,SNP的开发与应用却进展迟缓.为促进多倍体植物中SNP的开发,本文对多倍体植物中SNP标记开发所遇到的难题进行了阐述,并对多倍体中SNP标记开发方法进行了梳理,包括位点特异性引物的PCR片段直接测序,利用多倍体的近缘二倍体区分SNPs和部分同源序列间的差异(homoeologoussequencevariants,HSVs),利用2代测序技术大规模发掘SNPs,基于公共数据库的序列通过生物信息学分析获取候选SNPs,通过遗传(分离)模式的研究验证SNPs等.利用上述方法可实现多倍体植物中SNP标记的大规模开发.关 键 词:多倍体;单核苷酸多态性;标记开发;部分同源性中图分类号:Q78 文献标志码:A

HEDao-hua,XINGHong-yi,ZHAOJun-xing,ZHAOYan-ning,QICheng,WANGYan-ting(CollegeofAgronomy,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Singlenucleotidepolymorphism(SNP)discoveryinpolyploidplants.JournalofZhejiangUniversity(Agric1&LifeSci1),2011,37(5):485-492

Abstract:Singlenucleotidepolymorphism(SNP)isakindofDNApolymorphismingenomewhichresultsfromthevarianceofsinglenucleotide.Indiploidorganisms(suchashuman,Arabidopsisthaliana,Oryzasativa,etc.),manySNPmarkerswerediscoveredasgeneticmarkers,andhadbeenwidelyusedforpopulationparameterestimationandassociationmapping.However,SNPdiscoveryandapplicationinthepolyploidorganisms(suchasGossypiumhirsutum,Brassicanapus,Triticumaestivum,etc.)werelimitedandlagged.InordertofacilitateSNPdiscoveryinpolyploidplants,thispaperreviewedthegenomiccomplexityofpolyploidy,theobstacleandthesolutionsofSNPsdiscoveryinpolyploidplants,includingthesemethodsofsequencingofpolymerasechainreaction(PCR)ampliconsfromlocus-specificprimer,distinguishingSNPsfromhomoeologoussequencevariants(HSVs)throughlivingmodelsofallopolyploidancestralgenomes,useofnext-generationsequencingforSNPdiscovery,scanningalongseekingpotentialSNPsbybioinformaticstool,MendeliantransmissiontestofcandidateSNPs.Inconclusion,theapplicationsofsolutionsmentionedabovearefeasibleandreliableforthehigh- 收稿日期:2010-09-30

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30971821);陕西省自然科学基金资助项目(2010JQ3005);西北农林科技大学唐仲英育种基金资助项目(A212020901).

作者简介:贺道华(1975)),男,湖北随州人,博士,副教授,主要从事棉花育种与生物技术方面的研究.E-mail:daohuahe@nwsuaf.edu.cn.

通信作者:邢宏宜,男,副研究员,主要从事棉花遗传育种研究.E-mail:xinghongyi1169@163.com.

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throughputSNPdiscoveryinpolyploidplants.

Keywords:polyploid;singlenucleotidepolymorphism(SNP);markerdiscovery;homoeology

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单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)是指在基因组水平上由单核苷酸的变异所引起的一种DNA序列多态性.SNP现象在基因组中广泛存在,并具有很高的信息含量,在分析遗传变异、群体结构、图谱构建、数量性状位点(quantitativetraitlocus,QTL)定位、关联作图、图位克隆和标记辅助选择等方面具有广阔的应用前景[1].随着SNP检测和分析技术的进一步发展,尤其是与DNA芯片等技术的结合,它已成为第3代遗传标记,并有望取代目前最常用的简单序列重复(simplesequencerepeat,SSR)技术进入基因应用研究领域[2].

SNP分析技术有近百种,其中只有极少部分可用于开发SNPs,大部分只能检测已知的SNPs但不能发现新的SNPs[3].对未知SNPs进行分析,即找寻未知的SNPs,是SNPs标记进入应用领域的前提.检测未知SNP有许多方法,如梯度凝胶电泳(gradient

gel

electrophoresis,GGE)、单链构象多态性(single-strandconformationpolymorphism,SSCP)、变性的高效液相色谱检测(denaturinghigh

performanceliquid

chromatography,

DHPLC)、性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)、分子杂交、异源双链核酸分子多态性分析(heteroduplexnucleicpolymorphismassay,HPA)、简化代表性鸟法测序(reducedrepresentationshotgunsequencing,RRS)和错配裂解法(mismatchcleavage,MC)等,但这些方法只能发现DNA序列(或片段)中含有SNPs,不能探明突变的精确位置和碱基类别.要想探明突变的位置和碱基类别,必须对那些含有SNPs的DNA链进行测序.

借助于人类基因组SNP研究的方法和结果,研究者在植物中进行了SNPs的开发,已经在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)等二倍体植物中取得

[4]

了大量的研究成果.然而在多倍体植物中,如甘蓝型油菜(Brassicanapus)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、普通小麦(Triticumaestivum)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、马铃薯(Solanumtuberosum),SNPs的开发却相当缓慢.本文对多倍体植物中SNP标记开发所

遇到的难题进行了阐述,并对多倍体植物中SNP标记开发方法进行了梳理,以期为多倍体植物中SNP标记的大规模开发提供参考.

1 多倍体植物中SNPs开发的障碍

植物界,特别是与人类生产生活密切相关的栽培物种,大部分都是多倍体,如甘蓝型油菜、陆地棉、烟草、花生等属于异源四倍体,普通小麦属于异源六倍体;即使是大豆,也属于古四倍体(paleotetraploidy).还有一些植物如甘蔗、马铃薯、香蕉等属于高度杂合的同源多倍体.由于其多倍体(polyploid)及古多倍体(paleopolyploidy;如棉属[5]、大豆)的特性,基因组中存在直向同源(orthologous;不同物种之间的同源性)基因和数量不等的横向同源(paralogous;一个物种内由同一祖先复制而来的多个基因的同源性)基因,使得许多SNP开发、验证和检测方法不能完全从二倍体直接引用到多倍体的研究中来.当前在多倍体物种中,通过序列比对所发现的÷SNPs\"很多是品种内的多态性[也就是部分同源(异源多倍体内亚基因组间的同源性)序列间的差异(homoeologoussequencevariants,HSVs),或者基因家族成员间的核苷酸变异(paralogoussequencevariants,PSVs)],而不是品种间的多态性[即不是等位同源(homologous)序列间的差异,不是真正的SNPs].多倍体中SNPs的开发非常复杂,因为研究者必须区分:1)基因家族成员间的核苷酸变异(PSVs);2)部分同源序列间的核苷酸差异(HSVs);3)测序错误

第5期贺道华,等:多倍体植物中单核苷酸多态性(SNPs)的开发487

(sequenceerrors);4)等位同源序列间的差异(SNP).只有后者才可以作为遗传标记的SNPs.

多倍体植物中SNPs的开发还要考虑:1)多倍体植物的繁殖方式;2)是同源多倍体还是异源多倍体(autopolyploidorallopolyploid).对于自花授粉和常异花授粉的异源多倍体(如普通小麦、陆地棉等),通过多代自交可获得基因型纯合体,因此源自单个的基因型纯合体的单核苷酸差异通常仅包括PSVs和HSVs的2种序列差异,即由一个个体的扩增子测序出的多个单体型(haplotypes)必定不会来自同源基因.而对于同源多倍体(如甘蔗)和专性异交的异源多倍体(如三叶草),基因型高度杂合,由单个个体的扩增子测序出的多个单倍型还可能来自同源基因,即同一个体中存在的单核苷酸差异包括等位同源、横向同源和部分同源的3种序列差异;因此,在同源多倍体和专性异交的异源多倍体中,通过扩增子测序比对而预测出的许多÷SNPs\"不能通过孟德尔遗传试验的验证,也就是说,80%以上的÷SNPs\"属于HSVs和PSVs,或者是测序错误[6],不能作为遗传标记使用.

Ravel等以26个小麦品系为材料,针对21个基因进行PCR扩增,并直接进行测序;通过序列比对,挖掘SNPs.结果发现:检测出的大多数÷SNPs\"属于2个不同位点间的单核苷酸差异;因多倍化导致的基因组过大使得普通小麦中SNP的开发相当困难.又如陆地棉中逆境应答基因GhNAC家族至少含有6个成员

[8]

[7]

大多数基因是以基因家族的形式存在的,排除横向同源基因的干扰是无法回避的问题.总的来说,和二倍体相比,因部分同源基因的干扰(主要是异源多倍体中)和高度杂合(主要是同源多倍体中)的特性,多倍体植物中SNPs的开发相当缓慢.

2 位点特异性引物的PCR片段直接测序开发SNPs

根据候选基因或EST序列设计PCR引物,对PCR产物进行克隆测序;或者利用检测未知点突变的技术,先发现/确认点突变的存在,然后对突变区进行测序.在测序的基础上应用软件Genalys或DNAStar和Clustal等,分析测序结果,排除测序错误,开发SNPs. 为了消除部分直向同源、横向同源位点的干扰,使PCR扩增子仅源自等位同源位点,必须设计基因(位点)特异性引物,只对单个特定位点进行扩增,获得单扩增子,然后对PCR产物进行克隆测序[10].

如何设计基因(位点)特异性引物?通常,内含子的序列多样性高于外显子

[11]

.通过多倍体

中亚基因组间内含子的序列差异可以设计位点特异的引物,从而挖掘等位基因间的多态性[12].例如:利用物种间的共线性,Blake等[12]通过小麦cDNA-水稻gDNA的序列比对,确定小麦内含子的位置,设计外显子锚定(exon-anchored)的引物;以小麦gDNA为模板对内含子进行扩增,然后通过扩增产物对内含子进行测序,即获知目标基因的内含子序列(部分同源的3个内含子拷贝分别位于A、B和D亚基因组上).利用部分同源的3个内含子的序列差异,设计亚基因组特异的引物,针对多倍体中的单个位点进行扩增,通过测序和个体间序列的比较,发现SNPs.Blake等[12]对小麦淀粉合成途径中的3个基因(Agp-L,SUT,Wx)各开发出了亚基因组特异的引物(3对,分别对应于A、B和D亚基因组).Small等[13]采用这种途径对陆地棉中Adh基因进行了拷贝数和序列差异的研究.Ishikawa等对此法进行了修正,即选择水稻中的单拷贝基因(与小麦的

[11]

(GhNAC1~GhNAC6),且具有保守的内含子-外显子结构,蛋白质序列也高度相似.对于这样的家族式基因,由于横向同源基因的干扰,开发SNPs的难度极大.当然,多倍体中也有部分基因不存在基因家族,如棉属中控制细胞壁合成与纤维伸长的基因GhXTH1,在陆地棉中只有2个拷贝(分别位于部分同源的At、Dt亚基因组上),而在陆地棉的祖先基因组的二倍体现代种)))亚洲棉和雷蒙德氏棉中只有1个拷贝[9].对于这种非家族式基因,不存在横向同源基因的干扰;但是这种低拷贝(不存在基因家族)的基因,在多倍体中也只是极少的一部分,

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UniGene序列高度同源),确定为基因标点(landmarkuniquegeneloci,LUGs),然后对LUGs和小麦的UniGene进行序列比对,推测外显子的连接点,获得TaEST-LUGs以设计PCR引物(锚定在外显子上可对内含子进行扩增),最终开发出内含子中的InDels,从而为根据内含子的序列差异来设计位点特异的引物奠定了基础.目前,小麦中有大量的研究项目在利用基因(位点)特异性引物PCR和扩增子测序的手段进行SNPs的开发.

特异性引物,在甘蓝型油菜中消除了Bn-FAE1.1的干扰,开发出Bn-FAE1.2的SNP标记[17].

An等[18]根据基因R2R3-MYB的序列设计简并引物,对陆地棉(G.hirsutum)、亚洲棉(G.arboreum)和雷蒙德氏棉(G.raimondii)3个物种的gDNA进行扩增、克隆和测序(测序须有重复,以识别测序错误,并使被测克隆包含该基因的2个部分同源位点),再对所得序列进行系统发育聚类(phylogeneticclustering),排除陆地棉中的HSVs,开发出该基因的SNP标记.

3 利用多倍体的近缘二倍体区分SNPs和HSVs

异源多倍体均是由二倍体种间杂交后天然加倍而来.研究表明:三叶草(Trifoliumrepens)中具有部分同源性的O、Pø亚基因组分别与T.occidentale、T.pallescens的基因组高度相似[14];甘蓝型油菜(B.napus)中具有部分同源性的A、C2个亚基因组分别与白菜型油菜(B.rapa)、甘蓝(B.oleracea)的基因组维持着较高水平的共线性[15];陆地棉(G.hirsutum)中具有部分同源性的At、Dt亚基因组分别与亚洲棉(G.arboreum)、雷蒙德氏棉(G.raimondii)的基因组具有极小的序列分歧[16].这些二倍体被认为是异源多倍体祖先基因组的现代种.二倍体与多倍体亚基因组间的相似性、共线性为多倍体中区分SNPs和HSVs提供了材料基础. Hand等

[14]

4 利用第2代测序技术发掘

SNPs

第2代测序(nextgenerationsequencing,NGS)技术的发展使得测序费用大幅度地降低,测序效率极大地提高,大规模地DNA变异研究变得经济可行,SNPs的开发和应用也因而进入快速发展阶段[20].利用NGS技术(Solexa,Roche4和SOLID等),可以对大量个体的全基因组或转录组进行快速的测序,对所获得序列进行生物信息学分析,发掘候选SNPs.

Oliver等[21]选择燕麦(异源六倍体)的4个品种构建了cDNA文库,通过Roche4测序获得100万条序列,组装成127000余个重叠群,利用生物信息学分析筛除重叠群中HSVs,获得了9448个候选SNPs;对其中的96个位点,Oliver等利用高分辨率溶解(high-resolutionmelting,HRM)分析进行候选SNPs的验证,发现52个(占%)位点在作图群体的亲本间存在多态性,48个在作图群体中的分离符合孟德尔比例,44个SNPs被定位到连锁图谱上.Hyten等[20]把Roche4和Solexa2种NGS结果结合起来,在大豆基因组中进行高通量的SNPs开发,通过组装比对获得了3487个候选SNPs,其中2795个候选SNPs含有足够的侧翼序列,适宜设计SNP分型方法;Sanger测序表明86%的候选SNPs是真实的;利用GoldenGate分型鉴定表明,827

[21]

[19]

利用T.occidentale和T.

pallescens来区分三叶草中等位同源和部分同源的序列多态性.由于三叶草的亚基因组O与T.occidentale的基因组存在高度的相似性,从而可以充分地确认来自亚基因组O的序列,其余的即为来自三叶草亚基因组Pø的序列,据此Hand等[14]在三叶草中开发出9个基因的SNP标记.

Rahman等利用白菜型油菜(B.rapa)和甘蓝(B.oleracea)的BAC克隆,分别对甘蓝型油菜(B.napus)的部分同源基因Bn-FAE1.1和Bn-FAE1.2的侧翼序列进行测序,发现这2个基因的侧翼序列存在差异.据此设计位点

[17]

第5期贺道华,等:多倍体植物中单核苷酸多态性(SNPs)的开发4

个(占79%)候选SNPs获得确认.Trick等[22]对甘蓝型油菜的cDNA文库进行Solexa测序,然后利用MAQ软件(Ver0.6.8)进行序列比对和SNPs的筛查.Bundock等[23]通过Roche4测序在甘蔗基因组中开发SNPs;类似的研究在陆地棉中也已经启动

[24]

六倍体小麦中,通过重叠区的序列比对尽管发现大量的序列多态性,但Barker等认为只有一部分(占26%)可作为分子标记.Barker等[27]的方法的缺点是低估了SNPs的数量,因为同一品种内的基因家族成员间、部分同源序列间不可能完全序列一致.

Tang等[29]开发出软件QualitySNP,从而利用生物信息学的方法来排除测序错误、÷横向同源序列\"和÷部分同源序列\"3方面的干扰.首先对来自公共数据库的序列进行聚类,则÷等位同源序列\"和÷横向同源序列\"、÷部分同源序列\"都汇聚到同一簇(cluster)中;然后在该簇中定义单体型,根据所定义的单体型,识别出÷部分同源序列\"亚群、÷横向同源序列\"亚群和测序错误,最后的÷等位同源序列\"亚群中的单核苷酸多态性即为候选的SNPs.

基于比较基因组学的知识,根据模式植物水稻的序列信息,对来自公共数据库的麦属ESTs序列,先用CAP3程序进行组装(结果是所有的同源序列和部分同源序列、横向同源序列聚集到一起),再用SNP分析算法[32](SNP-analysisalgorithm)把横向同源与部分同源序列分离出来.这种分析可通过WheatEstimatedTranscriptServer(WhETS)来完成.Lucyshyn等[33]查询GenBank获得了353个EST可能为TaRPL3的序列,通过组装和SNP分析法则获得了6个重叠群;根据重叠群中ESTs序列的信息,推测这6个重叠群对应于横向同源的2组基因(RPL3-A和RPL3-B),并开发了RFLP标记以区分各组基因中3个部分同源基因:对于TaRPL3-A的3个部分同源基因(RPL3-A3,RPL3-A2,RPL3-A1),可以用Eco72I和Eco147I进行酶切;对于TaRPL3-B的3个部分同源基因(RPL3-B2,RPL3-B1,RPL3-B3),可以用NcoI和StuI进行酶切.因部分同源基因间的酶切位点不同,酶切后均产生各基因位点特异的片段,从而有效地区分TaRPL3基因家族的6个成员;通过RACE、TA克隆和测序,用DNAStar和GENEDOC进行序列分析,开发出TaRPL3-A3基因的SNP标记.

Spangenberg等[34-35]利用软件AutoSNP

[27]

.

5 基于公共数据库的序列信息,通过生物信息学分析开发SNPs

公共数据库中已有大量的表达序列标签(ESTs)、序列标签位点(STSs)、cDNA文库和gDNA等序列信息,在这些序列之间必然存在大量的重叠区域.运用计算机软件[25](如Polybayes和SNPpipeline等),对重叠区域进行序列比较,并运用一些软件(如XGAP)删除由测序造成的碱基错读,就可得到候选SNP甚至真正的SNP.这种策略可大大降低成本,已被用于SNP标记的大规模开发[26].

首先把下载的序列组装为重叠群(contig),通过序列比对获得重叠区段的单核苷酸多态性.当然这些多态性包括同源序列SNPs、HSVs和PSVs,以及测序错误;而且多倍体中因部分同源序列的存在会导致重叠区具有较高的序列多态性[27],若重叠群中有÷横向同源序列\"的存在,则重叠区的多态性更高;若重叠群仅含÷等位同源序列\则重叠区的多态性较低.如:小麦的部分同源序列间的变异频率是1HSV/24bp,同源序列间的变异频率为1SNP/0bp

[28]

.一般情况下,真正的SNPs会

共分离,数个多态性位点的核苷酸是协同变化的(即共分离从而形成特定的单体型[27,29-30]),而测序错误不会共分离(non-co-segregating),且因测序错误所产生的伪SNPs其冗余度(redundancy)较低.Batley等[31]利用SNPServer和AutoSNP计算重叠区中单核苷酸多态性的冗余度和共分离的冗余度.在排除测序错误的基础上,Barker等把÷SNP\"分类为品种内(直向同源、横向同源)SNPs和品种间(等位同源)SNPs;若SNPs所在序列在品种内无变化,仅在品种间有变化,则该SNPs通过验证的可能性较大,可以作为分子标记.在异源

[27]

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对三叶草的42017条EST序列进行拼接,在各重叠群的重叠区域进行SNP的挖掘,发现1409条基因序列中含有18517个SNP位点.Cogan等[36]对这些SNP位点进行了实验验证,并探讨了横向同源和部分同源对SNPs开发的干扰效应.

位基因的分离模式基本上符合基因组标记的分离比.只有经过孟德尔遗传试验验证,符合孟德尔分离比的eSNP才是真正可作为遗传标记的SNP.

7 结语与展望

当前,SNPs的研究已成为后基因组时代的主要内容之一,顶尖杂志在近几年发表了大量的开发SNPs的论文;高通量的SNP分型技术也在不断发展更新.国际上SNP数据库,如美国NCBI的dbSNP,欧洲的HGVbase,麻省理工学院的SNP数据库等,也在不断积累大量的SNP信息.Solexa,Roche4和SOLID等高通量的2代测序平台的成熟,海量序列信息的快速增长和生物信息学软件的不断推出为SNPs的开发提供了极大的便利.从某种意义上说,我们已进入SNPs时代.对人类SNPs的开发、描述及其在确定表型中的成功标志着一个新里程碑的出现[39],极大地促进了SNPs在动植物基因组研究中的应用.

植物的高度遗传多样性更有利于SNPs的开发.利用植物的近等基因系直接分析单体型SNP;利用内含子的序列差异,设计位点特异性引物,获得单扩增子,通过测序和个体间序列的比较,发现SNPs;利用多倍体的近缘二倍体来排除HSVs,从而开发SNPs;基于高通量NGS平台对大量个体的基因组或转录组进行测序,积聚含SNPs的序列;利用生物信息学分析开发候选SNPs;利用孟德尔分离群体分析eSNP的遗传分离模式从而验证SNP的真实性.这些都为多倍体植物中SNP的开发提供了可行的方案.

通过大批量、高通量SNPs的挖掘与验证,再加上高效低廉的SNP检测手段,有望为多倍体植物中SNP单体型遗传图谱的构建和关联分析等提供快速有效的途径,为多倍体植物基因组研究绘制出更加精细、实用的蓝图.

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6 通过遗传(分离)模式研究验

证SNPs

通过上述扩增子测序、近缘二倍体协助判别、高通量测序平台和生物信息学分析所获得的单核苷酸多态性只能称为÷电子SNP(electronicSNP,eSNP)\".多倍体的这些eSNP绝大部分是亚基因组间的多态性(HSVs),而非亚基因组内的SNP,因此只能称为÷半SNP(hem-iSNPs)\".如:Trick等[22]在甘蓝型油菜(B.napus)中发现,2个品种间的单核苷酸多态性有23330~41593个,但这其中的大多数(87.5%~91.2%)属于部分同源(A亚基因组与C亚基因组间)基因间的多态性.另外,有部分eSNP是因为未能完全剔除测序错误而产生的,故只能称为÷伪SNP(negativeSNP)\".一般序列分析的错误率是1bp/100bp,刚好相当于许多植物种内SNPs发生的频率[37];详细地搜索SNPs要检测许多基因型,这样又混合了序列错误.如果测序错误没被及时检测出来,将导致÷伪SNP\"的产生.

若要使挖掘出的eSNPs能够作为分子标记,从而用于连锁图谱构建、QTL定位、关联作图等工作,则需进行SNP验证.利用eSNP对孟德尔分离群体进行分型,研究eSNP在分离群体中的分离模式(即是否符合孟德尔分离比例)是验证eSNPs的最佳途径.Lawless等发现:多倍体的eSNP位点的等位基因,大部分在孟德尔分离群体(即家系作图群体、亲本和近缘二倍体物种的材料)中的分离不符合孟德尔分离法则,严重偏离孟德尔分离比例.此结论说明来自多倍体的eSNP大部分属于HSVs(即半SNPs)、PSVs和÷伪SNPs\不能通过SNP验证.Trick等利用DH群体对所挖掘的SNPs的遗传模式进行了研究,发现SNPs的等

[14]

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