ＬＩＳＨＩＺＨＥＮ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＡＮＤ ＭＡＴＥＲＩＡ ＭＥＤＩＣＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ２００８ ＶＯＬ．１９ ＮＯ．１１ 时珍国医国药２００８年第１９卷第１１期 又会冻伤植物，且其新陈代谢随温度降低减弱，也不利于秋水仙 比小苗幼嫩，细胞代谢更活跃，有利于秋水仙素发挥作用；第四， 素发生作用。一般认为适合的温度为１５￣（３左右。同时综合药液 种子在含秋水仙素的平皿上萌发，是有氧呼吸，可承受较高温度， 浓度与处理时间考虑，认为温度低时药液浓度可稍大，处理时间 而高温有利于秋水仙素渗透到组织深处。综合以上分析，种子浸 可稍长些，温度高时则降低药液浓度，缩短处理时间￣７，８ ３。 泡法优于幼苗浸泡法。 青蒿两片子叶期的幼苗生长点外露，利于诱变，但采用传统 参考文献： 的点滴法或棉花包埋法费时费工，且容易把幼嫩的小苗压断。本 ［１］ 中国中医药信息杂志通讯员．世界卫生组织呼吁中国增加青蒿素 实验采用幼苗和萌动种子浸泡法，可以一次性处理大批小苗，提 产量［Ｊ］．中国中医药信息杂志，２００５，１２（８）：１１０． 许杏样，朱杰，黄大中，等．青蒿素及其一类物结构和合成的研究 高了工作效率。小苗长时间浸泡在诱变液中，氧气缺乏，药剂毒 ［２］［Ｊ］．有机化学，１９８３，４１（６）：５７４． 害过大，死亡率和畸苗率均会增加，每天取出在空气中放置一段 Ｓｃｈｍｉｄ Ｇ．ｒｒ０ｔａＩ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｑｉｎｇｈａｏｓｕ［Ｊ］．Ｊ Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８３， 时间，有利其生活力恢复。在种子浸泡法中，如果不将种子预先 ［３］１０５：６２４． 在滤纸床上培养，挑取萌动露白种子，而直接用秋水仙素溶液浸 ［４］ 韦霄，李锋．不同栽培措施对黄花蒿产量和青蒿素含量的影响 泡干种子，很可能会由于种子间的生理差异，其萌动时间参差不 ［Ｊ］．广西科学院学报，１９９９，１５（３）：１３２． 齐，导致即使浸泡时间一样，而秋水仙素作用时间不一致，产生实 ［５］傅德明，蔡正江，毛禄国．青蒿生物学特性及规范化栽培技术［Ｊ］． 验误差。 中国农技推广，２００５，２１（１２）：３４． 幼苗浸泡法和萌动种子浸泡法比，后者较前者更好。首先， ［６］张秀芳，石东里，张兰，等．观察植物气孔结构的简易方法［Ｊ］．生 种子浸泡法利用低浓度的秋水仙素就能产生高诱变率，所需秋水 物学通报，２００２，３７（６）：４２． 仙素浓度仅是幼苗浸泡法的数百分之一，节约成本，对材料造成 ［７］石荫坪，李雅志．果树突变育种［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社， １９８６：２２６． 的伤害小；其次，采用幼苗浸泡法诱变后的幼苗很难同未诱变株 谭德冠，庄南生，黄华孙．组织培养与秋水仙碱诱导相结合培育植 区分，只能通过根尖细胞染色区别，而诱变后的种子萌发的幼苗 ［８］物多倍体的应用［Ｊ］．亚热带植物科学，２００５，３４（１）：７０． 茎膨大，明显有别于对照，便于在早期进行甄选；第三，种子幼胚 刺五加多糖对过氧化氢诱导海马神经元氧化 应激损伤及细胞凋亡相关基因一２家族的影响 波，唐 瑛 ，李德忠，邓惠玲，文 晔，王晓昆 （中国人民广州军区武汉总医院，湖北武汉４３００７０） 摘要：目的观察刺五加多糖（ＡＳＰＳ）对Ｈ：０：诱导海马神经元氧化应激损伤及细胞凋亡相关基因一２（Ｂｃｌ一２）家族的影 响，并探讨其可能机制。方法运用海马神经细胞原代培养技术，采用Ｈ ０ 诱导建立细胞氧化损伤模型。观察细胞形态 学变化；Ｍ１Ｔｒ法测定细胞活性；ＴＵＮＥＬ法，检测Ｈ，Ｏ，诱导大鼠海马神经元凋亡；免疫组化法检测细胞中Ｂｃｌ一２，Ｂａｘ蛋白 表达；化学比色法检测细胞匀浆液中一氧化氮合酶（ＮＯＳ），过氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的活性及丙二醛（ＭＤＡ）含量。结果 形态学观察显示：与模型组比较，ＡＳＰＳ组细胞损伤程度明显减轻；ＡＳＰＳ组细胞活性比模型组细胞活性高；ＴＵＮＥＬ法显示 ＡＳＰＳ预处理组细胞阳性率明显高于模型组细胞；ＡＳＰＳ组Ｂｃｌ一２表达量较高而Ｂａｘ表达量较低；ＮＯＳ活力及ＭＤＡ生成 量ＡＳＰＳ组明显低于模型组，但ＳＯＤ活力ＡＳＰＳ组显著高于模型组。结论ＡＳＰＳ能提高海马神经细胞的抗氧化应激损伤 能力并上调Ｂｃｌ一２基因表达，下调Ｂａｘ表达。 关键词：刺五加多糖； 海马神经细胞；氧化应急损伤； 细胞凋亡相关基因一２家族 中图分类号：Ｒ９６２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－０８０５（２００８）１１－２７０５－０３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｃｉｓ ｓｅｎｔｉｃｏｓｉ ＰＯｌｖｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｏｎ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ Ｄａｍａｇｅ ａｎｄ Ｂｃｌ一 ２ Ｆａｍｉｌｙ ｉｎ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｂｙ Ｈ２ Ｏ２ ＤＩＡＯ Ｂｏ，ＴＡＮＧ Ｙｉｎｇ ，Ｕ Ｄｅ—ｚｈｏｎｇ，ＤＥＮＧ Ｈｕｉ—ｌｉｎｇ，ＷＥＮ Ｙｅ，ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ—ｋｕｎ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＭｅｄｉｃａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，Ｗｕｈａｎ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｒｅｇｉｏｎ，Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｃｉｓ ｓｅｎｔｉｃｏｓｉ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｏｎ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｄａｍａｇｅ ａｎｄ Ｂｃｌ一２ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｂｙ Ｈ２ Ｏ２ ａｎｄ ｔｏ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｉｓ ｅｆｆｅｃｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｏｘｉ— ｄａｔｉｖｅ ｄａｍａｇｅ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｈ２ Ｏ２．Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ；ｔｈｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃ— ｔｅｄ ｗｉｔｈ ＭＴＦ ｍｅｔｈｏｄ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｈ２ ０２ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＴＵＮＥＬ ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ 一２ ａｎｄ Ｂａｘ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＮＯＳ，ＳＯＤ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＭＤＡ ｉｎ ｃｅｌｌ ｈｏｍｏｇｅ－ ｎａｔｅ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｍｅｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｄａｍａｇｅ ｏｆ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｅｎｓ ｗａｓ ｓｌｉｇｈｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ；ｔｈｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｈｉｐｐｏｅａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ＡＳＰ ｇｒｏｕｐｓ（４６％）ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔｉｎ ｍｏｄｅｌ ｒｏｕｐ（３６％）（Ｐ＜０．Ｏ１）；ｇｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｍａｓｃｕｌｉｎｅ ｉｎ ＡＳＰＳ ｇｒｏｕｐｓ ｗａｓ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ ＴＵＮＥＬ ｍｅｔｈｏｄ：ＡＳＰＳ ｃｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ一２ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｘ．Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＳＯＤ ｉｎ ＡＳＰＳ ｇｒｏｕｐｓ 收稿日期：２００８－０１－２０；修订日期：２００８－０７－０８ 基金项目：湖北省科技攻关计划（Ｎｏ．２００６ＡＡ４１２Ｃ０８） 作者简介： 波（１９８４．），男（汉族），安徽蚌埠人，现任中国人民广州军区武汉总医院实验师，主要从事中药药理研究工作． 通讯作者简介：唐瑛（１９６４一），女（汉族），江苏扬州人，现任中国人民广州军区武汉总医院主任医师，主要从事免疫药理研究工作． ・２７０５・ 时珍国医国药２００８年第１９卷第１ １期ＬＩＳＨＩＺｔｔＥＮ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＡＮＤ ＭＡＴＥＲＩＡ ＭＥＤＩＣＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ２００８ＶＯＬ．１９ ＮＯ．１ １ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ，ｂｕｔ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＮＯＳ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＭＤＡ ｉｎ ＡＳＰＳ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＡＳＰＳ ｃａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ—ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｂｙ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ一２ ｇｅｎｅ，ａｎｄ ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｘ ｇｅｎｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｃｉｓ ｓｅｎｔｉｃｏｓｉ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｅｓ；Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｄａｍａｇｅ；Ｂｃｌ一２ ｆａｍｉｙ 自由基是一类具有不配对电子的活泼化学基团。其中氧自 野，每个视野数５００个细胞，记录每个视野中凋亡细胞数，算出细 由基和氮氧自由基是与生命或健康相关的主要自由基类型。这 胞凋亡率。 些自由基可与许多生物大分子发生氧化损伤反应。目前认为衰 ２．７海马细胞中Ｂｃｌ一２与ｂａｘ表达量的测定 应用细胞 老、炎症、癌症、白内障、心血管疾病以及阿尔茨海默症、帕金森症 爬片技术，按上述进行实验分组，细胞培养至第１０天取出细 等神经退行性疾病都与自由基氧化损伤有关。抗氧化、减少过多 胞爬片，冰丙酮固定３０ ｍｉｎ，自然晾干。用０．３％Ｈ：Ｏ：甲醇 的自由基产生或促进机体产生内源性抗自由基物质、提高机体对 溶液，除去内源性过氧化氢酶；洗涤，１０％羊血清封闭２０ ｍｉｎ； 自由基氧化损伤的自我保护能力，可在一定程度上预防相关疾病 加入一抗（１：１Ｏ０兔抗鼠Ｂａｘ、Ｂｃｌ一２抗体）４℃冰箱过夜； 的发生或改善证候。因此，筛选和开发抗自由基物质受到医药界 ＰＢＳ洗涤３次；二抗（１：１００生物素化山羊抗兔）３７℃孵育 的广泛关注。本实验室通过采用Ｈ ０：诱导海马细胞氧化损伤 ２０ ｒａｉｎ；ＰＢＳ洗涤３次；ＤＡＢ显色，复染，脱水，透明，封片。每 模型，观察刺五加多糖对抗氧化酶和凋亡基因的影响。 张免疫组化片随机１０视野，采用ＨＰＩＡＳ一１０００高清晰度彩 １材料 色病理图文分析系统，选用阳性单位（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｕｎｉｔ，ＰＵ）指标 １．１药品刺五加多糖（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ， 定量表达免疫组化阳性反应。 ＡＳＰＳ）粉末，由湖北省中医药研究院新药研究室提供。 ２．８匀浆液的制备及各生化指标的测定 １．２试剂ＭＴＦ购自Ａｍｅｒｓｃｏ公司；阿糖胞苷购自Ｓｉｇｍａ公司； ２．８．１匀浆液的制备用预冷的高盐细胞裂液１ ｍｌ加入１ Ｘ １０ 胰蛋白酶、ＤＭＥＭ高糖培养基、胎牛血清、Ｂ 均购自ＧＩＢＣＯ公 个细胞・ｍｌ，０ａｔ温预２０ ｒａｉｎ，取出细胞裂解液，分装保存在 司；兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶抗体（ＮＳＥ）、Ｂａｘ和Ｂｃｌ一２抗 ８０％条件下。 体，ｓＡＢＣ以及ＴＵＮＥＬ试剂盒均购自武汉博士德生物公司；ＮＯＳ， ２．８．２ ＮＯＳ活力的测定ＮＯＳ催化Ｌ—Ａｒｇ和分子氧反应生成 ＳＯＤ和ＭＤＡ试剂盒均购自南京建成生物公司。 ＮＯ，ＮＯ与亲核性质物质生成有色化合物，在５３０ ｎｍ波长下测定 １．３动物ＳＤ孕鼠由湖北省医学实验动物中心提供，动物生产 吸光度根据吸光度大小计算出ＮＯＳ的活力。具体操作参照ＮＯＳ 合格证号：ＳＣＸＫ（鄂）２００３一Ｏ００５。 试剂盒说明书。 ２方法 ２．８．３ ＳＯＤ活力的测定黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生 ２．１ 大鼠海马神经细胞原代培养及实验分组 ．２ 无菌条件下 超氧阴离子自由基（０ ・），后者氧化羟胺形成亚盐，在显示 取出生３ ｄ以内的乳大鼠脑组织，分离海马，剪碎，０．２５％胰蛋白 剂下成紫红色，当样品中含有ＳＯＤ时，则对０ ・有专一性的抑 酶３７％，消化２０～２５ ｒａｉｎ，用接种培养液中止消化，吹打分散细 制，颜色变浅，通过公式计算出样品中ＳＯＤ的活力。具体操作参 胞，并用２００目的滤筛过滤制成细胞悬液，调整细胞数至１×１０。 照ＳＯＤ试剂盒说明书。 个・ｍｌ～，将细胞悬液按每孔１００ ｌ接种于９６孑Ｌ板，每孔２ ｍｌ ２．８．４ ＭＤＡ含量的测定氧化脂质产物ＭＤＡ能够与硫代巴比 接种于６孔板。将板置于３７℃，５％ＣＯ：培养箱中培养２４ ｈ后， 妥酸（ＴＡＢ）缩合，形成红色产物，通过比色法在５３２ ｎｍ测出 更换培养液，用含２％Ｂ： 的无血清培养液继续培养，第３天换用 ＭＤＡ的含量。具体操作参照ＭＤＡ试剂盒说明书。 含１％的阿糖胞苷培养液抑制杂细胞生长，以后每隔３ ｄ换液１ ２．９统计学处理与分析实验数据以 ±ｓ表示，通过统计软件 次，细胞培养至７ ｄ时供实验用。实验共分为６组：阴性对照组、 ＳＰＳＳ８．０进行显著性检验用单因素方差分析及ｔ检验。 模型组和４个ＡＳＰＳ组（终浓度分别为１０，５，２．５，１．２５ ｇ－ ３结果 ｍｌ ）。阴性对照组整个培养过程不加入任何处理因素，其余５ ３．１ 海马细胞生长状况及染色鉴定培养１０ ｄ神经元相互之 组细胞培养至第７天时，加入终浓度为１ ｍｍｏｌ・Ｌ 的Ｈ，Ｏ，以 间，神经元和非神经元（主要是星形胶质细胞）之间形成相互联 制作损伤模型。 系，连接成紧密的网络，神经元主要生长在非神经元之上。免疫 ２．２海马神经细胞鉴定取生长有海马细胞的盖玻片，冰丙酮 细胞化学染色证实培养的细胞即为神经细胞。见图１。 固定，免疫组织化学染色，加入０．３％Ｈ Ｏ：甲醇，以除去内源性 过氧化氢酶，正常羊血清封闭２０ ｍｉｎ，加入兔抗鼠ＮＳＥ抗体（１： ５０），４￣Ｃ冰箱过夜，ＰＢＳ洗涤３次，生物素化山羊抗兔ＩｇＧ（１： １００）３７ｑＣ孵育２０ ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤３次，ＤＡＢ显色，复染，脱水，透 明，封片，光镜观察。 ２．３海马细胞Ｈ Ｏ 损伤模型的建立取培养７ ｄ的海马神经细 胞去除原培养液后，损伤组加入无血清培养液ＤＭＥＭ，加入终浓 度为１ ｍｍｏｌ・Ｌ 的Ｈ Ｏ：培养１ ｈ后，ＤＭＥＭ洗２次，换上无血 清的ＤＭＥＭ培养液，置于３７℃，５％ＣＯ 培养箱中继续培养２４ ｈ。 图１ ＮＳＥ免疫组织化学染色（４０×） ２．４形态学观察倒置显微镜观察神经元的生长状态及形态的 变化，并拍摄原代培养的海马神经细胞。 ３．２形态学观察 ２．５ ＭＹｒ法测定海马细胞活性 细胞培养与造模方法均同 ３．２．１ 对照组神经元胞体饱满，周围有光晕，轴、树突细长明 前，在Ｈ ０ 损伤前２４ ｈ给药各组按实验设计给药，然后再加入 显，交织成网络，见图２。 Ｈ：０２损伤。实验结束前４ ｈ加入２５ ｉｘｌ Ｍ＇ＩＴ（终浓度为１ ｍｇ・ ３．２．２模型组神经元胞体皱缩，周围光晕下降，轴、树突断裂， ｍｌ ），吸去培养液，每孔加入二甲基亚砜１５０ Ｉｘｌ，待孔内颗粒完 并延突起方向出现大量空泡，见图３。 全溶解后，用酶标仪测定５７０ ｎｍ处的光密度（ＯＤ）。 ３．２．３ ＡＳＰＳ组当ＡＳＰＳ终浓度为１０，５，２．５ ｇ・ｍｌ 时，神经 ２．６ ＴＵＮＥＬ法检测凋亡细胞应用细胞爬片技术，按上述进行 元形态有所改善，较多细胞保留轴、树突，但仍见凋亡或坏死细 实验分组，细胞培养至第１０天取出细胞爬片，４％多聚甲醛固定 胞。当ＡＳＰ终浓度为１．２５ ｇ・ｍｌ 时，神经元损伤严重，较模 ３０ ｍｉｎ，自然晾干。用ＰＢＳ洗涤２次，５ ｍｉｎ／次，应用ＴＵＮＥＬ试剂 型组改善不大，见图４～７。 盒检测凋亡细胞。参照阳性切片，辨出凋亡细胞，随机１０个视 ・２７０６．
