微生物菌种保藏方法

微生物菌种保藏方法

菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。

(一)常规保藏方法

1 目的

1.1 了解菌种保藏的基本原理

1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。

2 原理

菌种保藏的方法很多。其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。

3 材料

3.1菌株

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待保藏的适龄菌株斜面

3.2培养基

肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。

3.3 试剂

10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。

3.4 器具

用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。

4 流程

斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏

5 步骤

5.1斜面保藏

5.1.1流程

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标记试管→接种→培养→保藏

5.1.2步骤

5.1.2.1贴标签

取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。

5.1.2.2斜面接种

将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。

5.1.2.3培养

置37恒温箱中培养48小时。

5.1.2.4保藏

斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一船可保藏三个月至半年。

5.2半固体穿刺保藏

5.2.1流程

标记试管→穿刺接种→培养→保藏

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5.2.2 步骤

5.2.2.1贴标签

取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。

5.2.2.2穿刺接种

用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。

5.2.2.3培养

置37恒温箱中培养48小时。

5.2.4保藏

半固体直立柱长好以后，放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一般可保藏半年至一年。

5.3石蜡油封存

5.3.1流程

标记试管→接种→培养→加石蜡油→保藏

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5.3.2 步骤

5.3.1标记

同5.1.2.1

5.3.2接种

同5.1.2.2

5.3.3培养

同5.1.2.3

5.3.4加石蜡油

无菌操作下将5毫升石蜡油到培养好的菌种上面，加入的量以超过斜面或直立柱1厘米高为宜。

5.3.5保藏：石蜡油封存以后，同样放入4℃冰箱中保存。也可直接放在低温干燥处保藏。这种方法保藏期一般为一至二年。

5.4砂土管保藏

5.4.1 流程

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制沙土管→灭菌→制菌液→加样→干燥→保藏

5.4.2 步骤

5.4.2.1制作沙土管

选取过40目筛的黄砂，酸洗，再水洗至中性，烘干备用；过120目筛子的黄土备用；按1份土加4份砂的比例均匀混合后，装入小试管，装量1厘米左右。

5.4.2.2灭菌

加压蒸汽灭菌，直至检测无菌为止。

5.4.2.3制备菌液

取3毫升无菌水至待保藏的菌种斜面中，用接种环轻轻刮下菌苔。震荡制成菌悬液。

5.4.2.4加样

用1毫升吸管吸取上述悬液0.1毫升至砂土管，再用接种环拌匀。

5.4.2.5干燥

把装好菌液的砂土管放入干燥器或同时用真空泵连续抽气，使之干燥。

5.4.2.6保藏

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干燥后的砂土管可直接放入冰箱中保藏；也可以用石蜡封住棉花塞后放冰箱中保藏。

（二）冷冻干燥保藏法

1目的

1.1理解冷冻干燥保藏菌种的原理

1.2掌握冷冻干燥保藏菌种的方法。

2 原理

冷冻干燥保藏菌种法可克服简单保藏方法的不足。利用有利于菌种保藏的—切因素，使微生物始终处于低温、干燥、缺氧的条件下，因而它是迄今为止最有效的菌种保藏法之一。

3 材料

3.1 菌株

待保藏的各种菌种。

3.2试剂

2% HCl；牛奶。

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3.3器具

安瓿管、标签、长滴管、脱脂棉、干冰、离心机、冷冻真空装置、高频电火花器。

4 流程

备安瓿管→备脱脂乳→制菌悬液→分装→预冻→真空干燥→保藏→活化

5步骤

5.1准备安瓿管

安瓿管先用2%HCl浸泡，再水洗多次，烘干。将标签放入安培管内，管口塞上棉花，灭菌备用。

5.2制备脱脂乳

用鲜奶经处理或使用脱脂奶粉配兑脱脂牛奶，灭菌，并做无菌试验后备用。

5.3制菌悬液

将无菌牛奶直接加到待保藏的菌种斜面内，用接种环将菌种刮下，轻轻搅乱使其均匀地悬浮在牛奶内成悬浮液。

5.4分装

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用无菌长滴管将悬浮液分装入安瓿管底部，每支安培管的装量约为0.9毫升。(一般装入量为安瓿管球部体积的1／3)

5.5预冻

将分装好的安瓿管在-25至-40之间的干冰酒精中进行预冻1小时；或在冰箱冷冻室进行预东。

5.6真空干燥

预冻以后，将安瓿管放入真空器中，开动真空泵进行干燥。

5.7封管

封管前将安瓿管装入歧管；真空度抽至0.01毫米汞拄后，再用火焰熔封，封好后，要用高频火花器检查各安瓿管的真空情况。如果管内呈现灰蓝色光，证明保持着真空。检查时高频电火花器应射向安瓿管的上半部。

5.8保藏

做好的安瓿管应放置在低温避光处保藏。

5.9活化

如果要从中取出菌种恢复培养，可先用75%酒精将管的外壁消毒，然后将安瓿管上部在火焰上烧热，再滴几滴无菌水，使管子破裂。在用接种针直接挑取松散的干燥样品，在

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斜面接种。

菌种保存和微生物常识

1、常用培养基的制备、灭菌与消毒

营养：从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，满足生长和繁殖需要的一种生理过程。是生命活动的物质基础，是生命活动的起点。

营养物：具有营养功能的物质。也包括光能。提供生物的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。

营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水

培养基：人工配制、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合养料。要求：应具备6大营养要素；物质比例合适；必须灭菌。

2、选用和设计培养基的原则、方法及制备过程

原则：目的明确 、营养协调、经济节约

物理化学条件适宜

方法：生态模拟、查阅文献

精心设计、试验比较

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步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、

加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查

培养基种类：

一、按成分的不同分

天然培养基、合成培养基、半合成培养基

二、按培养基的物理状态分

固体培养基、液体培养基、半固体培养基

三、按培养基用途

基础培养基、选择培养基 、加富培养基鉴别培养基

消毒与灭菌 ：

消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体

灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。

方法：

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一、物理的方法：加热、过滤、辐射

二、化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。

加热法：

（1）干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。

1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。

2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160－170C）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。

3、注意事项：

1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法；

2）温度控制在<180°；

3）物品不能太挤；

4）温度降至70°时才开箱门。

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（2）湿热法 ：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。

高压蒸汽灭菌法：

1、设备：高压灭菌锅

2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。

3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。

4、注意事项：

1）冷空气彻底排除；2）加水；3）压力降为“0”时方可打开。

常压蒸汽灭菌：对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基，含糖培养基等可采用此法。彻底灭菌则采用间歇灭菌方法。

煮沸灭菌法：适用注射器和解剖器皿，时间10－15min，

超高温杀菌:135-150°C和2-8s对牛乳和其它液态食品。优点 ：保持食品价值和营养成分。

过滤除菌：

原理：介质在有压力时阻隔微生物。

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适用范围：许多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。

设备：蔡氏过滤器，滤膜过滤器。

优缺点：不破坏培养基成分，只适用少量滤液。需 大量无菌空气以及净化工作台。

注意事项：1、压力适当；

2、无菌条件下进行；

3、防止渗透现象。

辐射灭菌：

原理：紫外线波长在200－300nm，具有杀菌作用，以265-266杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收；可产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和时间的乘积成正比。

缺点：穿透力不大。距照射物<1.2m为宜。

应用：无菌室，医院。

注意事项：对眼睛和皮肤有刺激作用。

射线灭菌：r射线，穿透力强，适用于堆积物品的灭菌。

化学药品灭菌：

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原理：应用化学制剂破坏细菌代谢机能。

杀菌剂如重金属离子；

抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。

注意：与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类以及微生物所处的环境有关。

常用化学杀菌剂有：乙醇、醋酸、石碳酸

、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等

3、微生物的分离、纯化及培养技术

分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程。

为什么要进行纯培养：平板上的单一菌落并不一定保证是一种菌。

常用的分离、纯化方法：

单细胞挑取法 稀释涂布平板法

稀释混合平板法 平板划线法

稀释涂布平板法 ：

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步骤：

1、倒平板： 牛肉膏蛋白胨培养基，高氏I号培养基，查氏培养基冷却至55-60℃时，混匀后倒平板，牛肉膏蛋白胨培养基倒4皿，高氏I号培养基和查氏培养基各倒3皿。

2、制备污水稀释液：10g土样，加入90ml无菌水中，在三角瓶中振摇20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml无菌水的试管中，以此类推，制成不同稀释度。

3、涂布：将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然后用无菌吸管从最后三种稀释度，即10-4、10-5和10-6的试管中吸取0.1ml对号放入平板上，用玻棒涂布。

4、培养：高氏I号和查氏倒置培养于28℃培养箱中培养3-5days，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在37℃培养1-2days。

5、挑菌落：转至斜面，检查是否一致，保存。

平板划线法：

1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。

2、划线方法

稀释混合平板法 ：

1、先加菌

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2、倒平板时注意培养基温度

3、混合均匀

4、微生物培养技术

1、斜面接种

2、液体培养基接种

3、穿刺接种

4、将已接种的斜面、半固体和液体培养 基放置培养箱中培养

5、将生长好的菌种用牛皮纸包好，置4℃冰箱中保存。

几种常用的保藏方法：

1、传代培养法

保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，置4C˚冰箱中存放，定期进行传代培养、再存放。

可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体石蜡来进一步延长保存期。

2、载体法

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使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。

常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。

3、悬液法

将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。

溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。

4、冷冻法

使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。包括低温法和液氮法。

此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。注意控制降温速率及保护剂的使用。

5、真空干燥法

这类方法包括冷冻真空干燥法和L－干燥法。

冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。

L-干燥法则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在10－20C˚范围内进行真空干燥。

操作方法

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1、斜面保藏法

将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C˚冰箱中包藏。

保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。

此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。

2、液体石蜡保藏法

将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1CM为准，使菌种与空气隔绝。

将试管直立，置低温或室温下保存。

此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通细菌也可保藏1年左右。

3、穿刺保藏法

按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好后用胶塞封严，置4℃冰箱存放。

4、砂土管保藏法

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(1)河砂处理

取河砂若干加入盐酸10% ，加热煮沸30min除去有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。

(2)土壤处理

取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。

(3)砂土混合

处理妥当的河砂与土壤按3：1的比例掺合(或根据需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均匀后，装入10x100mm的小试管或安瓿管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌(通常采用间歇灭菌2--3次)，最后烘干。

(4)无菌检查

每10支砂土管随机抽1支，将砂土倒入肉汤培养基中，30℃培养40h，若发现有微生物生长，所有砂土管则需重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌后方可使用。

(5)菌悬液的制备

取生长健壮的新鲜斜面菌种，加入2-3ml无菌水(每18x180mm 的试管斜面菌种)，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成菌悬液。

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(6)分装样品

每支砂土管(注明标记后)加入0．5ml菌悬液(刚刚使砂土润湿为宜)， 用接种针拌匀。

(7)干燥

将装有菌悬液的砂土管放入干燥器内，干燥器底部盛有干燥剂。用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口)。

(8)保存

置4℃冰箱或室温干燥处，每隔一定的时间进行检测。此法多用于产芽孢的细菌、产生孢子的霉菌和放线菌。在抗生素工业生产中应用广泛、效果较好，可保存几年时间，但对营养细胞效果不佳。

5、冷冻真空干燥法

（1）冻干管的准备：中性硬制玻璃，烘干，灭菌。

（2）菌种培养：细菌芽孢脱落；放，霉孢子丰满。

（3）保护剂的配制：配制，灭菌，检查。

（4）菌悬液的制备：2-3ml保护剂。

（5）分装样品：菌悬液每管0.2ml。

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（6）预冻：程序控温仪降温。

（7）冷冻真空干燥：-50℃下抽真空。

（8）取出样品：轻敲松散即达标。

（9）第二次干燥。

（10）熔封。

（11）存活性检测：抽取一管进行存活性检查。

（12）保存：4℃保存。

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