生物孩术通报·技术与方法·年第期转录组与一技术张春兰`,“秦孜娟,王桂芝“纪志宾王建民“'潍坊学院生物与农业一〔程学院,潍坊山东农业大学动物科技学院,泰安摘要转录组是特定细胞或组织在特定时间或状态下转录出来的所有的集合。通过对转录组的研究可以揭示生物体的基因表达、研究结构变异及发现新基因等。转录组分析的研究方法、研究平台发生着日新月异的变化,同时生物信息学分析的内容也在逐渐完善。一作为一种新的转录组研究手段,利用新一代测序技术能够更为快速、准确地为人们提供更多的生物体转录信息。主要比较近年来转录组研究的几种方法和几种一的研究平台,并着重介绍一的原理、用途、步骤和生物信息学分析等及在相关领域的应用等内容,为相关的研究和应用提供参考。关键词转录组一新一代测序技术一`”,,,,'召卿。耐加。俄扣鳍,妙,热扣鳍认二加鳍卯动了,乡行`,,耳罗嗯·,〕'一幻,,,,'一任〕五一一群在人类基因组项目后,转录组学、蛋白组学和常指所有的总和川。本文以下的说明以狭义代谢组学等组学不断涌现,生命科学的研究已经跨一为主。人后基因组时代。其中,转录组学作为一个率先发与基因组不同,转录组更具有时间性和空间性。展起来的学科是研究细胞表型和功能的一个重要手例如,人体大部分细胞具有一模一样的基因,而即段,是研究基因表达、基因结构和功能的一个新型使同一细胞在不同的生长时期及生长环境下,其基的研究方向。因表达情况也是不完全相同的。所以,除了异常的所谓转录组广义上是指生物体细胞或组织在特降解现象如转录衰减以外,转录组反映定状态下所转录出来的所有的总和。包的是特定条件下活跃表达的基因。括编码蛋白质的即和非编码蛋白质研究转录组的基本方法的,如、、等目前研究转录组的方法主要有基于杂交而似乎更引人关注,所以狭义上的转录组通技术,如芯片和寡聚核昔酸芯片基于收稿日期一一基金项目山东省农业良种工程重大课题作者简介张春兰,女,博士研究生,研究方向动物遗传育种与繁殖一通迅作者王建民,男,博士生导师,研究方向羊品种资源保护一自卫峨物杖术通推口勿群“年第期测序技术,如早先基于和测序的、全长。文库和文代测序技术。新一代测序技术较测序技术通量更高、运行时间更短、测序片段更长。现在通常将基于第二代测序技术的转录组测序分析称为。种主要的转录组研究方法的比较,见表。其中〕尼测序一高通量测序库的测序分析。现在对、等的测序工作已升级为第二表技术原理一具有以下优势通量高。运三种转录组研究方法的比较芯片杂交信号分辨率通量荧光模拟信号数个一高数字化信号单碱基低数字化信号单碱基高饰背景噪声分析成本起始用量高高多是低高多有限的基因表达低低少是同时映射转录区域和基因表达能够区分不同的亚型能够区别等位基因表达有限有限是是是是用第二代测序平台可得到几个到几百亿个碱基序列,可以达到覆盖整个基因组或转录组的要求灵敏度高。可以检测细胞中少至几个拷贝的稀有转录区域',一法在过去的测序平台世纪年代发明的双脱氧测序测序领域占据着多年中一直在等于本分辨率高。一的分辨率能达到单个碱基,准确度好,同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题不受性。可以对任意物种进行全转录组分析,主要地位。虽然技术在不断改进,但要进行大规模测序其价格还是比较昂贵。同时传统方法测序的速度慢,获取的信息量小,远远满足不了目前研究的需要。而一测序平台突破传统测序技术,为无需预先设计特异性探针,能够直接对任何物种进行转录组分析。同时能够检测未知基因,发现新的基因组和基因的测序研究提供了有效手段。表近年来发展的几种主要测序平台比较。为转录本,并准确地识别可变剪切位点及表平台测序原理可逆染料终结合成测序、几种主要测序平台的比较〔'〕伴焦磷酸合成测序连续测序单分子合成测序平均读长每费用一一一〕一〕一准确率主要错误类型运行时间一一替换插人、缺失替换缺失优点缺点性价比高读长短目前应用最广泛读长最长运行速度快准确率最高读长短运行时间长产量高文库制备简单,不需要增或连接失误率高扩费用最高现在公司生产、测序较,见表。其中因其售价便宜、占地面积平台在国内也广泛被应用,现将其各种测序平台比小、测序速度快而被称为个人型测序系统,实现了2012年第月泪张春兰等表公司以洲〕以转录组与一技术种测序平台的比较〔“以】洲〕《平台最大产量单个读取末端配对读取袅共亿个洲刃万个通道共一亿个侧洲〕亿个通道共共亿个亿个通道亿个亿个通道共巧亿个共亿个通道亿个亿个通道图共亿个共读长粼洲〕万个通道共巧亿个亿个通道饰万个万个通道共万个万个通道许多普通实验室的测序梦想,让新一代测序触手可及。而系列测序系统由于其一次测序数据量大,通道多,更适合于多个样品同时测序。一的主要用途一技术能够在单核昔酸水平对特定物种的整体转录活动进行检测,从而全面快速地获得该物种在某一状态下的几乎所有转录本信息。由于转录组测序可以得到全部主要应用于转录本的丰度信息,加之准确度又高,使得它具有十分广泛的应用领域。检测新的转录本〔,'〕,包括未知基因转录水平研究,如非编渊反转录合成双链街熬狱撼魏李韶八冉人】,形奥终鑫脚一序接头连`一热粉一姗然议转录本和稀有转录本码区域功能研究,如”、发和基因表达量、不同样本间差异表达〔,'。〕仁”〕、非编码长编辑”等,,,,〕。扩增测序文库月杯转录本结构变异开涕呻一一争研究,如可变剪接仁',”了、基因融合'`,`,深度测序一的原理及基本步骤后,根据所测种类进行一—户寨一份户一一一卜瓣安提取样本总度分离纯化。再进而片段化为所用测序平台所需的长或反转录后片段化,反转录后连接测序接头。扩增达到一定丰度上机测序,直到获形成全基因组范围的图像识别一一一一一争序列信息零酬奎黎翁越韶撇彝移啥奏舞琴炙孤舞黎姿烤澎翻媒参港蒙撼接着利用从头组装得足够的序列。所得序列通过与参考基因组比对或转录谱。试验流程,如图所示。图一试验流程生物信息学分析及在相关领域的应用由测序仪产生的图像信息经过除污染序列个低质量的后,然后将低质量。对于去掉处理如果一转换成碱基序列。对原始测序数据进行初步处理去中存在个以上不能识别的碱基则认为其为的生物信息学分析接有参考基因组的比对分析及应用选择已经公布的相同或相近物种的基因组和基因信息为参考,将所测数据的数据中,进行比对分析。基因的结构优化分析通过,在基因组上的分布、末端配对信息以及现有基因注释结果,对基因结构进行延伸优化、域鉴定。等〔'利用,,边界鉴定及区测序平台对白色至参考基因组下来如下有两种处理办法。生物技术通报刀舒刀点年第期杜洛克与二花脸杂交脂进行一末端延伸至少的'端延伸至少不同组织利用测代猪的肝脏、背最长肌和腹一巧个基因的`一一一个基因个基分条基因的连接,则这两个基因将作为基因融合的候选。目前基因融合现象多见于肿瘤或癌症组织,等'丁对。等上`〕对个人前列腺癌组织的转录本进行高通量测序分析,发现了新的基因融合现象。个中国汉族人的原发性前列腺癌和一分析,揭示前列腺癌他们的正常组织进行分析,对所得长,对所得帅,并且对其中测序平台进行因的两端都作了延伸处理。等川水稻的种分析,预析,对所得注释基因的'端进行了长的序列。中存在多个基因融合现象。及分析通过比对转录本和参考基或。因组间的序列,寻找潜在的砂等'对组测序分析,开发了码。巨转录组分析,开发了起始密码子上游的开放阅读框架约需预测新基因现有数据库中对转录本的注释可能还不全面,通过的分布以及基因注释集合,在基因组上发现新基因。纯等'〕比较了绵羊的正常组和骨延迟愈合组的基因表达谱,与绵羊基因组比对后发现了比较后发现了个新的转录本。个新的转录本。等`〕比较了不同发育时期牛胚胎的转录本,与牛基因组差异表达基因分析比较不同样品间表达差异的基因,给出在每个样品中上调或下调基因。李新建〔'。」比较了荣昌猪和长白猪的转录本,筛选出个差异表达显著的基因。基因功能注释将所测与数据库中已注留,基因以释功能的基因相比对进行的分子功能、生物学过程和细胞组件和中个欧洲后代进行了转录个人基因组上的的。编个具有多态性的。,等”对荷斯坦奶牛乳样品进行无参考基因组组装分析及应用当无参考基因组时,以获得基因。中已公布的有拼接的非冗余关数据为参考,将测序数据经过软件拼接从头组装重叠群和组装情况分析将测序所得短利用组装软件从头组装。首先将具有一定长度重叠的连成更长的片段,称之称为回不同。列用得到含,,以及这些。补充,将这些。然后将比对,通过末端配对来确定来自同一转录本的,之间的距离,未知序连在一起得到。〕做补洞处理,最后。。,基因和基因产物、基因编码产物、新陈代谢途径等分析。等〔吕〕对不同发育期牛胚胎利用行一性分析。进行了个和等”〕采用分析。测序平台进富集测序平台对牛角癌组织个转录本分析,对所得差异基因进行了进一步利用末端配对对最少,两端不能再延长的序列,称之为和正常角组织转录本分析,并对。如果同一物种做了多个样品测序,则不同样品组装得到的可通过序列聚类软件做进一步序列拼接和去冗余处理,得到尽可能长的非冗余功能注释基因比对进行得基因数据进行了对基因进行了和与数据库中已注释功能的功能注释。王斌”〕对工具对所软件等〔'〕利用一分析,并利用分析。纯可变剪切分析可变剪接使一个基因产生多转录本,不同可能翻译成不同蛋等“〕对拟南芥含有内含子的基软件白。通过末端配对及接合序列的对比,结合已有的基因注释鉴定可变剪切形式。的一分析发现至少有约因进行了可变剪切。变剪切时会出现的信号。基因融合分析如果末端配对的条来自于不同的基因,并且有足够的的两支持两米曲霉菌的转录组分析,利用等〔`,」利用分析了人已有数据库中的基因,分析了基因发生可测序平台对绵羊骨愈合延迟和正常组的腿骨进行了一分析,从头组装产生了个类和,对表达有显著差异的转录本进行了聚分析。20一年第期张春兰等转录组与一技术及发品种的提供支持。个一。和和分析通过一,可以开生物信息学分析软件的再开发。测序虽然得到了大量的数据,但基于有限的生物信息学分析软件,经常导致人们所对要分析的东西不能得到很好的结果,造成测序数据的浪费。读长越长,越需要更少的读长更长,通量更高。去拼接形成一个基,从而为品种先育及疾病诊断。等〔'`〕利用个潜在的。测序平台对两个等”利用种不同油含量的个个品种西葫芦进行从头组装转录组分析,开发出。以〕测序平台对一因,因而错误率越低。或者更长的读长意味着可以在一次测序过程中完成一个基因甚至几个基因的测定。目前虽然发展起来的度能达到测序平台测序长以上,但测序费用的昂贵使得许多花生种子进行,从头组装后得到,共开发了个,并对其中的多态性进行了实验室证实。基因差异表达分析等'〕比较了禁食比较不同样品间表达与正常饮食的奶和科研工作者望而却步。综上所述,虽然发展和测序成本的进一步降低,一一技差异的基因,给出在每个样品中上调或下调基因。山羊间脂肪组织间的基因表达,两组分别有的变化,。。等'运用术还面临着种种困难,相信随着相关学科的进一步必将为基因的研究提供强有力的手段,并在转录组学研究领域占据主导地位。也相信随着测序技术的不断进步,人们能够对转录组开展更为深人的测序工作,能够发现更多、更可靠、更有用的转录本。参考文献个表达不同的基因。为了揭示松鼠冬眠中基因测序平台对全年个时间点松鼠的心肌、骨骼肌和脂肪组织进行分析,组装后比较发现了多个不同时间点不同组织间差异表达的基因。和“分析。等”〕利用测序平台对一只长白猪的肌肉和卵巢进行对所测序列进行了组装,并对转录本进行了西葫芦的分析。和以上的分析。一分析,个显著表达的。等〕对进行功能注释和,,,一,」,,,《刃,一一脚【」梁烨,陈双燕,刘公社新一代测序技术在植物转录组研究中的应用遗传,,,,·一一面临的挑战与展望卿,随着高通量测序技术的发展,以基因组学为代表的生命科学得到了前所未有的繁荣和飞速发展。作为一个刚刚起步的新技术,速度应用于各种生物组织中。虽然一已以惊人的一已经显,,一「〕祁云霞,刘永斌,荣威恒转录组研究新技术应用遗传,〔」仁妙,一,,一及其,可,昭,一娜示出其他分析技术无可比拟的优势,如能为物种提供单碱基分辨率的转录组注释、提供全基因组范围的“数字化”基因表达谱、成本比芯片和序低等,但是还存在一些缺陷。下几个方面还有待于进一步完善原理发展了多种技术,如成测序,出来的、一测技术在如测序技术的」,叮刀一一八石,,,改进和测序费用的降低。目前虽然利用不同的测序测序平台为焦磷酸合测序平台为可逆染料终结合成测和可变剪切的假阳性率较高。,,,玩序,但测序过程中还存在一定的错误率,使得开发可群56生物杖术通推,一,一盯“一盯年第期〕李新建究〔猪脂肪沉积关键基因筛选及杨凌西北农林科技大学,基因功能研」,,一一,,,一二石脚仁」,,,。。目。,卜卯一幼,,一一,,竹,,,」,一,,,,一晓,,一〕一,,,,行,,习呵,,盯,,一一〕,五,叩,乙一,【」王斌米曲霉转录组学研究【广州华南理工大学,,一」,,,疵,,,详尸叩。」,',一,,,〕,,,一,,,」曲,一,“仪为,罗,一,,。一,,即己,讯一,【〕,,,一肠,,罗,,一〕,。日”,,,。,。。。。斗即尽,山,一可卯,,一,,一么,,一,叮责任编辑狄艳红
