免疫组化和PCR方法检测乳癌腋窝淋巴结微转移的比较

免疫组化和PCR方法检测乳癌腋窝淋巴结微转移的比较

目的 探讨通过不同方法检测腋窝淋巴结MUC1基因表达，以提高微转灶诊断率。方法 收集200-2012年我院收住的手术病人26例，108个常规组织学检查阴性的腋窝淋巴结，分别用免疫组化及RT-PCR法测定MUC 1 mRNA的表达。结果 MUC 1 mRNA阳性检出率为66%，明显高于蛋白表达检出率21%。（P＜0.05）。结论 建立起MUC 1 基因的RT-PCR分析法，进一步提高微转移灶诊断率，较免疫组化更为敏感。

标签：MUC 1 粘蛋白；乳腺肿瘤；免疫组化；RT-PCR

淋巴结微转移是指常规病理难以发现的50%者。根据细胞浆粽染再结合细胞形态确定微转移。

组织粽RNA提供采取异硫氰酸胍。AMV逆转录酶42℃作用60min合成cDNA，再以此为模板结进行PCR循环。循环参数为94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，40个循环。阴性对照用未做逆转录的总RNA做模板，空白对照在扩增时不加Taq DNA聚合酶。RT-PCR结束后，取扩增产物10，进行2%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，Kodak Digital Science凝胶成像系统照，得出结果。

1.3 统计分析 两种结果统计处理用X2检验。

2 结果

2.1 MUC 1基因免疫组化结果 ，MUC 1蛋白在癌变细胞中表达于胞膜和胞浆（图1，2），微转移表现为单个散在或2-3个及数个聚集成小团状的癌细胞位于淋巴结内。个别淋

巴结内巨噬细胞，浆细胞等可见MUC 1交叉反应，结合细胞形态特点部位及染色特征可以区分。

2.2 乳癌患者MUC 1 mRNA 表达情况 临床样本MUC 1 和内参照B2-微球蛋白基因扩增分别得到288bp和150bp左右的条带，与所设计的片段大小相符。空白对照组和阴性对照均未见扩增条带。

20例乳腺病人的108个HE染色未见转移的淋巴结中71个经RT-PCR扩增后有MUC 1 mRNA表达，阳性检出率为66%。8例乳腺组织，7个HE阳性淋巴结及6例正常乳腺组织MUC 1 mRNA阳性表达率分别为100%、100%及100%。。

2.3 不同方法检测MUC 1 基因表达结果比较 在109个常规病理学检查阴性的淋巴结中，免疫组化发现23个有MUC 1 蛋白的表达，再进一步行RT-RCR检测发现71个表达MUC 1 mRNA，表明肿瘤隐蔽淋巴结转移的存在，这种转移可能是一个或数个肿瘤细胞转移引起的。RT-PCR法使微转移灶的诊断由免疫组化的21%增加到66%，经统计学分析两种方法阳性检出率有显著差异（P＜0.005），提示RT-RCR法更为敏感，大大提高了微转移灶的诊断率。

3 讨论

乳癌发病率逐年上升，目前以外科手术为最主要的治疗手段。影响乳癌患者术后预后的因素很多，其中腋窝淋巴结有无转移、淋巴结转移量、水平和部位对临床选择治疗方案及预后评估至关重要。研究表明：恶性肿瘤细胞的转移是主要致死因素，而淋巴道转移是主要转移途径之一，淋巴结转移与生存率呈负相关[5]。有统计表明淋巴结阴性的乳癌患者术后5年内仍有20%左右死于远处转移，可以认为这些患者在诊断之初可能就存在隐蔽的

淋巴结转移或全身转移[6、7]，用常规的组织病理方法甚至免疫组化方法都不易发现，需要寻找更为敏感有效的标志物或方法来解决这一问题。

检测转移肿瘤细胞，需利用能区别于转移部位组织而肿瘤细胞特异性表达的生物学标志物。因乳癌绝大数都发源于上皮组织，故上皮组织的某些特异性标志物可作为转移肿瘤细胞的标志物用于淋巴结中微转移灶的检测。MUC 1黏蛋白是一种高分子量膜糖蛋白，其分布具有明显的组织特异性，主要在于某些上皮组织和器官中，如乳腺，胰腺，卵巢和结肠等，特别是在所有正常及乳癌组织中均表达而在间叶组织来源的淋巴结中不表达。

灵敏特异的RT-PCR法的应用，随着循环次数的不同，Taq酶用量的不同可能会提高方法的敏感性，但也由此导致假阳性结果的可能，需不断改进。我们用PCR法对微转移研究的最终目的是选择病理学上腋淋巴结阴性乳癌患者中的高危复发人群，以指导临床预后，而并非是该方法的最大敏感性及对临床分期的具体知道。目前对于高灵敏度方法检出的微转移灶其生理意义仍有争议。有研究表明，存在淋巴结微转移的乳癌患者预后不良。微转移癌细胞进入淋巴结后可能有3种转归：（1）继续增生形成大转移灶最终全身转移；（2）被机体免疫系统清除；（3）暂时进入静止期，待环境适宜时，再增生形成大的转移瘤。故RT-PCR法检出微转移的患者并非一定复发，但可能提示有形成转移倾向。相信随着观察例数的增多，随访时间延长，微笑转移灶的临床意义会更加明显。